家蚕作为重要的无脊椎动物模型，在其变态发育过程中组织形态会发生巨大变化，因此是研究细胞增殖、分化、凋亡及自噬等生理现象理想的材料。GATA结合蛋白因子是从低等的线虫到高等的哺乳动物发育过程中都需要的非常重要的调控因子，参与个体胚胎发育、组织器官发生、个体衰老等重要的生命活动。本研究以家蚕作为研究对象，利用家蚕基因组数据库获得家蚕GATA结合蛋白序列信息，并重点对BmGATA6-like基因的功能进行分析及研究，将有利于阐明家蚕变态发育的分子调控机理，促进对昆虫变态发育的全面认识，不仅可以为害虫的生物防治提供线索，甚至还能为人类的退行性疾病提供数据参考。主要研究结果如下：　　1.家蚕GATA结合蛋白家族基因的鉴定　　通过NCBI及家蚕全基因组数据库，分析获得5个家蚕GATA结合蛋白家族基因，分别为BmGATA-A-like，BmGATA-C-like，BmBCF I，BmGATA6-like和BmGATA-X。同其它物种中的GATA结合蛋白类似，它们都具有保守的GATA锌指结构域，其中BmGATA-A-like和BmGATA-X只含有一个GATA锌指结构域，BmGATA-C-like，BmBCFI和BmGATA6-like都含有两个典型的GATA锌指结构域。5龄3天家蚕各组织芯片数据显示家蚕GATA结合蛋白的表达量较低，且各成员间的表达情况存在较大差异。保守结构域的进化分析显示家蚕GATA结合蛋白家族成员主要与昆虫的GATA结合蛋白聚为一类，其中BmGATA-A-like与果蝇的Pannier聚为一类，BmBCFI与赤拟谷盗的GATAa及果蝇的Serpent聚为一类，BmGATA6-like与鳞翅目昆虫的GATA结合蛋白聚为一类，BmGATA-X与意大利蜂的GATA4-like最为保守，而BmGATA-C-like则单独聚为一类；保守结构域的物种间多序列比对显示GATA锌指结构域序列同源性非常高。　　2.家蚕BmGATA6-like基因的克隆与表达分析　　通过家蚕基因组数据库预测序列信息及NCBI blast序列，克隆得到家蚕BmGATA6-like基因全长cDNA序列（为了简洁，后文中将以BmGATA6代替称呼BmGATA6-like）。该基因全长为4011bp，含有10个外显子和9个内含子；其ORF框长1974bp，编码657个氨基酸，预测的蛋白分子量为70.8kDa，等电点pI为6.13。BmGATA6蛋白含有两个典型的GATA锌指蛋白结构域，分别位于第464~516位氨基酸基序和524~576位氨基酸基序；在线软件预测其不含信号肽。利用实时荧光定量PCR技术检测其在家蚕胚胎、5龄3天各组织中的相对表达水平，结果显示BmGATA6基因在家蚕胚胎发育各个时期均有表达，在胚胎发育的后期持续高表达，在胚胎发育第6天及孵化出的蚁蚕中表达量最高；5龄3天各组织中，BmGATA6在各个组织中均有不同程度的表达，但是在中肠中的表达量显著高于其它组织。检测BmGATA6在表达较高的中肠组织和表达较低的血液不同时期的表达情况，结果显示中肠组织中BmGATA6持续表达，并且在眠期及变态发育前期显著高表达；血细胞中BmGATA6的表达模式与中肠组织中的表达模式极其相似，同样是在眠期及变态发育时期显著高表达。免疫荧光检测BmGATA6在中肠组织和血细胞中的表达定位情况，结果显示BmGATA6在家蚕中肠所有类型的细胞中均有高量表达，且只集中表达于中肠组织细胞的细胞核中；L5D3家蚕血细胞中，检测到BmGATA6在颗粒细胞中有微量的表达，且只在颗粒细胞的细胞质中表达，浆细胞中不能检测到BmGATA6信号。这些结果暗示着BmGATA6基因在家蚕生长及变态发育过程中扮演重要角色。　　3.家蚕BmGATA6-like基因诱导细胞凋亡机制研究　　构建BmGATA6过表达载体，通过细胞转染的方法在家蚕胚胎细胞系BmE中过表达BmGATA6基因。Western blotting结果显示转染后24h BmGATA6蛋白就开始表达，且随着时间的延长其蛋白含量也逐渐增多。荧光显微镜观察结果显示从转染后48h开始，细胞逐渐出现细胞碎裂的现象，转染后72h及96h，其周围细胞碎片明显增多。分别用DAPI及Tunel染色进行细胞凋亡检测，DAPI染色结果显示过表达BmGATA6的细胞核结构松散，染色质呈不规则形状分布；Tunel染色后计数结果显示Tunel的着色率明显高于对照组。荧光定量PCR检测转染过表达BmGATA6基因后BmE细胞中家蚕凋亡相关基因的表达量变化，结果显示相关基因表达量被显著上调；凋亡执行蛋白Caspase3/7活性检测显示其活性也被明显上调。以上实验说明BmGATA6可以诱导家蚕细胞发生凋亡。　　利用BmGATA6抗体进行免疫沉淀，并将得到的产物进行蛋白质质谱分析鉴定，筛选得到可能与BmGATA6互作的蛋白数量为11个，根据分子量大小及功能等因素最后确定可以促进细胞发生凋亡的PARP为目的蛋白；免疫荧光共定位实验验证PARP与BmGATA6蛋白共同在细胞核中表达；进一步免疫共沉淀实验验证BmGATA6可以与PARP蛋白相互作用。这些结果暗示BmGATA6诱发的细胞凋亡可能与PARP蛋白的相互作用相关。　　4.FOG蛋白抑制BmGATA6诱发细胞凋亡　　通过比较在家蚕胚胎细胞系BmE和家蚕卵巢细胞系BmNs中分别过表达BmGATA6的现象，发现不表达家蚕FOG因子BmUsh的BmE细胞系相较于高量表达BmUsh的BmNs细胞系，BmGATA6过表达诱发的凋亡现象更为快速且更为明显。同时在BmE细胞系中过表达BmGATA6和BmUsh，经显微镜观察结果显示由BmGATA6诱发的细胞凋亡明显得到了抑制；Tunel染色后，统计结果显示与单独过表达BmGATA6基因相比，共同过表达BmGATA6和BmUsh基因的Tunel信号数量明显下降，且Caspase3/7的活性也明显降低。结果说明家蚕的FOG因子BmUsh可以抑制由过表达BmGATA6诱发的细胞凋亡。　　通过原核表达及蛋白纯化，获得具有活性的BmGATA6重组蛋白，利用Far-western证明BmGATA6可以与BmUsh蛋白相互作用，且其作用区域在BmGATA6的N端；进一步免疫共沉淀实验也验证了家蚕FOG因子BmUsh蛋白可以在与BmGATA6共同过表达的情况下与PARP蛋白结合，但是单独过表达BmUsh时不能与PARP结合。说明BmUsh通过与BmGATA6结合间接与PARP相互作用。　　荧光定量PCR检测家蚕中肠组织和血细胞中BmUsh和BmGATA6的时期表达变化，进行比较发现中肠组织中BmGATA6表达量较高，血细胞中BmUsh表达量较高，但无论是在中肠组织还是血细胞中，两者的表达模式极为相似，都在眠期及变态发育时期高量表达。由此结果推测家蚕FOG因子BmUsh与BmGATA6在眠期和变态时期通过相互作用，共同调控家蚕的正常生长及变态发育。　　5.家蚕BmGATA6基因的功能　　综合上述结论与分析，我们推测家蚕BmGATA6在家蚕生长及变态发育过程中，被某些生长因子或者激素等诱导上调表达，在组织细胞发生程序性死亡过程中，通过与PARP蛋白的相互作用或者其它目前还未知的调控机制共同诱导家蚕组织细胞发生凋亡，当凋亡程度达到预期水平后，FOG因子BmUsh再通过与其直接作用抑制由其诱导的凋亡，共同维护家蚕生长及变态发育过程的顺利进行。