研究背景与目的根据2018年癌症统计报告,前列腺癌（prostate cancer,PCa）约占新诊断癌症的五分之一,发病率随年龄增长而增加,并且是男性中最常见的癌症（164,690例新发病例）^[1]。从SEER数据库中的报告来看,虽然PCa的5年生存率非常高（98.2%）,但对于5%的确诊时已有远处转移的男性,他们的5年生存率仍然只有30%^[2]。相比于西方发达国家,我国的PCa发病率处于较低水平,但随着生活方式的改变、人口老龄化及前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）检测的普及,PCa发病率也呈迅速抬升趋势,且初诊患者中,晚期患者所占比重较高,已成为威胁中国男性健康的重要疾患之一^[3]。恶性肿瘤是一种基因组水平的疾病,每个人独特的基因组决定了我们患上肿瘤的风险,其中某些重要基因的突变在肿瘤发生中起着关键作用,而且肿瘤一旦发生,又会进一步造成癌细胞基因组的不稳定并进一步造成其他独特的突变和基因组重排,随着大量体细胞突变和基因组重排的积累,肿瘤持续演进,耐药性或转移的风险提高。这个过程中,对癌症发生发展起关键作用的突变被称作驱动性突变,涉及的基因被称作驱动基因,而剩下的突变就被称为乘客突变^[4]。近年来,靶向治疗已成为治疗癌症的有效策略,其也可作为手术切除后的新辅助治疗以降低癌症复发率。但是靶向治疗的效用依赖于对肿瘤发生发展过程中的特异靶点的精确鉴定。新一代测序技术（Next Generation Sequencing,NGS）又称作二代测序,已日渐成为癌症研究中的宝贵工具,它能够以单碱基分辨率分析基因组畸变,包括脱氧核酸点突变、剪接异构体、非编码RNA、DNA甲基化以及蛋白核酸相互作用。然而,目前的二代测序技术检测到的表达量明显改变的基因不一定在疾病过程中起作用,干预这些基因后也往往没有明显的表型改变,在鉴定真正驱动基因上效率不高^[5]。为了筛选出肿瘤中的驱动基因,Chen S等引入了CRISPR文库技术^[6],CRISPR/Cas9技术是近年来备受关注的基因编辑技术,除了可以在特定位点进行基因敲入、基因敲除等基本功能外,还有基因干扰、基因激活等衍生技术^[7],在临床疾病上的科研及应用非常广泛。Chen S等通过构建小鼠全基因CRISPR文库,根据表型确定基因,成功在67405个基因中找到了624个引起肺癌转移的基因。但是,全基因CRISPR文库的筛选无疑将耗费巨大的人力、物力、财力,另外将所有基因纳入研究,往往有一定的丢失率,而且筛选到的基因在癌症中的实际突变率可能很低,使得真正的肿瘤驱动基因被忽略。因此,本硕士研究课题主要是将二代测序与CRISPR文库筛选策略相结合,利用PCa癌及癌旁组织的高通量测序的结果,建立PCa特异性的gRNA文库,筛选在PCa发生发展中起关键作用的驱动基因。此外,我们还应用了新兴的生物信息学技术来预测了可能参与PCa转移的驱动基因并预测了具有潜在抗PCa活性的化合物。最后,我们在临床样本和细胞系中验证了驱动基因并证实了这些药物的有效性。第一部分:基于CRISPR技术的前列腺癌驱动基因的筛选及鉴定目的:利用CRISPR文库筛选PCa特异的驱动基因,并初步鉴定其功能。方法:（1）构建CRISPR慢病毒文库（含盐酸稻瘟菌素（BSD）抗性）。（2）细胞转染和细胞阳性表型的筛选。（3）Ta克隆高通量测序鉴定文库及富集基因。（4）siRNA干扰驱动基因复现其表型。结果:（1）利用本实验室65对PCa癌及癌旁组织转录组测序中的差异基因构建了CRISPR文库。（2）在RWPE-1、C4-2B、DU 145、LNCap、PC-3细胞中使用CRISPR文库转染并得到了稳转细胞株,连续传代后得到了在细胞增殖过程中富集到的克隆。（3）通过Ta克隆及高通量测序鉴定了文库及富集程度最高的基因MMS22L。（4）通过siRNA干扰MMS22L及EdU实验复现了其对细胞增殖的抑制作用。结论:通过前期得到的二代测序结果,构建了PCa相关的CRISPR/Cas9文库并构建了稳转细胞株。进而通过细胞增殖富集得到了克隆并鉴定出MMS22L基因,并且复现了其对细胞增殖的抑制作用。第二部分:基于生物信息学的前列腺癌驱动基因的筛选及候选药物鉴定目的:通过公共数据库筛选PCa转移相关的驱动基因并鉴定潜在的抗PCa药物。方法:（1）基于从GEO数据库获取的转移性PCa表达谱芯片数据集GSE6919和NCBI-Gene数据库收集的数据进行加权基因共表达网络分析（Weighted correlation network analysis,WGCNA）并筛选出了10个驱动基因。（2）在我院收集不同Gleason评分的PCa组织样本并通过QRT-PCR技术在组织及不同细胞系中对驱动基因进行鉴定。（3）从DrugBank数据库中预测调控驱动基因的候选抗PCa药物。结果:（1）共收集到72例PCa患者组织样本,其中低Gleason评分（Gleason score=6,7）45例,高Gleason评分（Gleason score=8,9,10）27例。（2）10个驱动基因中,5个基因的表达量与前列腺癌细胞系的恶性程度相关,该5个基因中4个基因表达量与临床样本的Gleason评分相关。（3）从DrugBank数据库中寻找调控驱动基因的化合物后共得到211种候选抗PCa药物。结论:通过对转移性PCa表达谱芯片数据和NCBI-Gene数据库收集的数据进行WGCNA筛选出了10个驱动基因,筛选得到的驱动基因在组织及细胞中得到了良好的验证,并且通过DrugBank数据库,我们得到了211种可能有抑癌活性的药物。第三部分:候选药物活性验证及氧化铜对前列腺癌细胞的特异性抑制作用鉴定目的:在细胞系中验证候选药物活性及氧化铜对PCa细胞的特异性抑制作用。方法:（1）使用化合物库对候选药物在RWPE-1及不同PCa细胞系进行CCK-8实验,鉴定具有抗肿瘤活性的药物。（2）通过CCK-8实验确定氧化铜对PCa细胞及RWPE-1的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。（3）通过Transwell实验及Invasion实验分别明确氧化铜对肿瘤细胞迁移及侵袭的影响。（4）使用PI/Annexin V-FITC双标流式细胞术明确氧化铜对PCa细胞的调亡诱导作用。（5）使用QRT-PCR技术初步鉴定氧化铜对不同PCa细胞系的调亡诱导作用与CIRBP基因表达量的相关性。结果:（1）我们选择了Connection>3的36种药物构建了了化合物库,并根据CCK-8实验确定了17种可明显抑制PCa细胞的化合物和4种特异性靶向PCa细胞的化合物。（2）氧化铜对于PCa细胞的增殖抑制作用明显强于正常前列腺上皮细胞。（3）氧化铜能显著抑制多种PCa细胞系的迁移及侵袭能力。（4）氧化铜可选择性诱导PCa细胞凋亡。（5）CIRBP表达量的改变与氧化铜对细胞凋亡的诱导作用一致。结论:我们鉴定得到了17种可明显抑制PCa细胞的化合物,其中氧化铜可特异性抑制PCa细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并且可特异性诱导肿瘤细胞凋亡,驱动基因CIRBP的改变与氧化铜诱导肿瘤细胞凋亡的效应相一致,提示CIRBP可能在氧化铜对肿瘤细胞的杀伤效应中发挥了作用。小结我们的研究始于本实验室前期对65对PCa癌及癌旁组织行高通量全转录组测序的结果。进而基于CRISPR技术筛选得到了驱动基因MMS22L并验证了其功能。此外,我们通过公共数据库结合生物信息学技术筛选了10个驱动基因并且筛选到了靶向驱动基因的药物,并且在细胞和临床样本中验证了驱动基因从而明确了筛选策略的效能,然后根据候选药物构建了化合物库在细胞系中验证了这些药物的抗肿瘤活性。最终,我们聚焦于氧化铜并且在细胞系中证实了其可特异性抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并且初步证实了驱动基因CIRBP的改变与氧化铜诱导肿瘤细胞凋亡的效应相一致,提示CIRBP可能在氧化铜对肿瘤细胞的杀伤效应中发挥了作用。本课题利用PCa癌及癌旁组织表达谱测序的结果,将生物信息学、CRISPR文库和二代测序三种技术相结合,筛选在PCa发生发展过程中起关键作用的驱动基因,并且预测了可能的抗PCa药物,为前列腺癌诊断、分子分型、预后判断及新药开发提供了依据,为研究前列腺癌的分子机制提供了新策略。