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大肠癌是我国常见的恶性肿瘤，在全球范围内它的发病率和致死率都比较高，并且有年轻化和上升趋势。大肠癌发病机理尚不清楚，早期诊断仍有困难，由于症状不明显，确诊时往往已到肿瘤的晚期。目前，治疗大肠癌首选手术以及术后常规化疗，手术后5年生存率不到40％。化疗和放疗的联合应用取得一定疗效，但也并不十分令人满意。所以，研究大肠癌的发病机理，探讨一种新的治疗方法，尤为必要。腐胺、精脒和精胺统称为多胺，是一类参与细胞内多种功能反应的多聚阳离子脂肪族化合物，这些阳离子电荷使得多胺可通过静电作用与细胞内的含有多聚阴离子的大分子化合物如DNA、RNA、蛋白质等发生反应而调控细胞增殖。多胺及多胺代谢相关的酶参与细胞生长、分化和死亡的调节，是细胞的关键调节分子。多胺对于正常细胞的生长是必须的，同时多胺的异常代谢在肿瘤的发展过程中又发挥重要作用。在迅速增殖的正常细胞以及肿瘤细胞中，多胺的含量明显升高。人们早已认识到多胺含量增高与结直肠癌的发生发展密切相关，多胺明确地参与大肠癌的发展，与肿瘤的预后和复发有明显的相关性，甚至被看作是大肠癌检测的肿瘤标志物。鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase，AdoMetDC）是多胺生物合成的两个关键酶。ODC是多胺合成的第一个限速酶，它能催化鸟氨酸脱羧生成腐胺。作为多胺合成途径中的第二个限速酶，AdoMetDC的作用主要是催化S-腺苷甲硫氨酸脱羧形成丙氨基，丙氨基再在精脒合成酶和精胺合成酶的作用下使腐胺逐级形成精脒和精胺。在结直肠肿瘤中，ODC和AdoMetDC的活性比相应的正常组织高3～4倍。作为肿瘤治疗的靶分子，ODC和AdoMetDC受到广泛的重视。ODC和AdoMetDC的竞争性抑制剂防治肿瘤的实验在动物实验中已初见成效，但由于其副作用较大，临床研究受到限制。为研究结直肠肿瘤发病机理，探讨肿瘤的基因治疗方法，该文利用先前实验中所构建的能同时表达ODC和AdoMetDC双反义RNA的重组腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas，将其感染大肠癌细胞，观察其对大肠癌细胞增殖的作用，结果显示其能有效抑制ODC和AdoMetDC基因表达，使细胞周期阻滞于G1期，使细胞增殖受到抑制，起到防治大肠癌的作用。为进一步研究Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞周期调控的分子机理，该文又观察了Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞周期蛋白（cyclin）和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）基因表达的调控作用。结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas对CDK基因表达无明显作用，但可抑制G1期主要的细胞周期蛋白cyclin D1的转录和翻译，并下调cyclin D1启动子的活性，同时抑制其上游调节蛋白β-catenin的核聚集，从而证明Ad-ODC-AdoMetDCas可能是通过下调cyclin D1启动子活性，抑制其基因表达，引起细胞周期阻滞，而起到抑制细胞增殖的作用。因该研究需要ODC和AdoMetDC抗体，之前已经制备获得ODC单抗，但AdoMetDC抗体当时尚难以获得，所以为完成该项研究，该文首先构建了AdoMetDCα亚基原核表达载体，在大肠杆菌中表达AdoMetDC融合蛋白，纯化后免疫小鼠，制备了鼠抗人AdoMetDC多克隆抗体。ELISA和Western blotting验证该抗体可与AdoMetDC特异性结合，并检测证明结直肠癌组织中AdoMetDC基因表达增高。这不仅为该文的完成提供了实验材料，也为探讨以多胺代谢为靶标建立结直肠癌早期诊断方法提供了技术素材。第一部分人AdoMetDC蛋白α亚基原核表达载体的构建、表达、纯化及其多克隆抗体的制备[目的]：构建AdoMetDC蛋白α亚基的原核表达载体，并表达纯化以获得重组人AdoMetDCα亚基融合蛋白，制备抗人AdoMetDC抗体，为后续研究奠定基础。[方法]：1．RT-PCR扩增AdoMetDC-αcDNA全长，通过TA克隆技术将其插入原核表达载体pTriEx-4中，构建重组的表达质粒pTriEx-AdoMetDC-α。2．将构建的重组表达质粒pTriEx-AdoMetDC-α转化入大肠杆菌E.coli JM109（DE3），诱导表达AdoMetDC-α蛋白，SDS-PAGE鉴定表达产物。3．运用亲和层析的原理应用HisTrapTM蛋白纯化试剂盒纯化出AdoMetDC-α蛋白，SDS-PAGE及Western blotting鉴定纯化产物。4．将纯化的AdoMetDC融合蛋白和免疫佐剂共同制备成免疫原，免疫小鼠，取血清制备抗AdoMetDC多抗；ELISA及Western blotting测定血清抗体的效价及特异性。5．免疫组织化学法检测大肠癌及正常大肠组织标本中AdoMetDC的表达量。[结果]：1．RT-PCR扩增出AdoMetDC-αcDNA全长。2．构建出重组表达质粒pTriEx-AdoMetDC-α，经酶切鉴定和DNA序列测序分析，证明该质粒含有AdoMetDC基因α亚基的编码序列的全长，开放阅读框架正确。3．重组表达质粒pTriEx-AdoMetDC-α转化入表达菌，诱导表达，表达产物经纯化，SDS-PAGE及Western blotting鉴定，表达蛋白为32kD，与预期结果相符。4．制备出抗人AdoMetDC多克隆抗体，并测定了其抗体效价及特异性。5．免疫组织化学法检测结果显示癌组织中AdoMetDC表达量明显高于周围正常组织。[结论]：成功构建出含有AdoMetDC基因α亚基的编码序列的原核表达载体pTriEx-AdoMetDC-α；在E.coli JM109（DE3）中表达重组蛋白，经HisTrapTM蛋白纯化柱纯化得到纯化的重组AdoMetDC-α蛋白；并以其为免疫原制备了抗人AdoMetDC多克隆抗体，为后续的研究工作奠定基础。第二部分ODC和AdoMetDC双反义RNA重组腺病毒抑制大肠癌细胞增殖的研究[目的]：研究同时表达ODC和AdoMerDC双反义RNA的重组腺病毒载体Ad-ODC-AdoMetDCas对大肠癌细胞的增殖的抑制作用。[方法]：1．通过细胞活力检测，确定Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞合适的感染效率。2．细胞活力检测Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞增殖的影响。3．采用Western blotting检测Ad-ODC-AdoMetDCas对大肠癌细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达的抑制作用。4．流式细胞术检测Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞周期分布的影响。[结果]：1．HT-29细胞的感染复数确定为50MOI。2．以50MOI的Ad-ODC-AdoMetDCas感染大肠癌细胞72小时后，可明显抑制细胞的增殖，最大生长抑制率可达65％。3．Ad-ODC-AdoMetDCas感染HT-29，可明显抑制细胞中ODC和AdoMetDC基因表达，其抑制率均大于50％。4．流式细胞术检测结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas使细胞周期阻滞在G1期。[结论]：Ad-ODC-AdoMetDCas可有效抑制ODC和AdoMetDC基因表达，使细胞周期阻滞于G1期，使细胞增殖受到抑制，起到防治大肠癌的作用。第三部分ODC和AdoMetDC双反义RNA重组腺病毒引起大肠癌细胞周期阻滞于G1期的分子机理研究[目的]：观察Ad-ODC-AdoMetDCas对G1期主要的细胞周期调节蛋白的调控作用，研究Ad-ODC-AdoMetDCas引起大肠癌细胞周期阻滞于G1期的分子机制。[方法]：1．Western blotting检测Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞周期调节蛋白cyclin D1和CDK蛋白水平的影响作用。2．半定量RT-PCR法检测Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞内cyclin D1和CDK4的mRNA水平的影响作用。3．通过克隆技术构建cyclin D1启动子的荧光素酶报告质粒（pGL3-D1），检测Ad-ODC-AdoMetDCas对cyclin D1启动子活性的影响。4．采用Western blotting法检测Ad-ODC-AdoMetDCas对细胞内β-catenin蛋白表达的影响。[结果]：1．Western blot结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas抑制G1期主要的细胞周期蛋白cyclin D1的表达，抑制率达60％；但对CDK4的表达无影响；2．RT-PCR结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas抑制cyclin D1的转录，对细胞内CDK4的转录无影响。3．构建出cyclin D1启动子的荧光素酶报告质粒（pGL3-D1），且证明Ad-ODC-AdoMetDCas可抑制该cyclin D1启动子活性，使其活性下调40％以上。4．Western blotting结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas对β-catenin蛋白的表达无影响，但可抑制该蛋白的核聚集。[结论]：Ad-ODC-AdoMetDCas抑制G1期主要的细胞周期蛋白cyclin D1的转录和翻译，并下调cyclin D1启动子的活性，同时抑制其上游调节蛋白β-catenin的核聚集，从而证明Ad-ODC-AdoMetDCas可能是通过下调cyclin D1启动子活性，抑制其基因表达，引起细胞周期阻滞，而起到抑制细胞增殖的作用。该文通过成功构建AdoMetDC-α亚基的原核表达载体pTriEx-AdoMetDC-α，在E. coli JM109（DE3）中诱导表达并纯化了带有His·Tag的融合蛋白，进一步以该重组蛋白为免疫原，制备抗人AdoMetDC抗体，并利用该抗体研究发现，大肠癌组织中AdoMetDC的表达远远高于其癌旁正常组织，提示AdoMetDC基因表达可作为大肠癌病因、基因诊断及基因治疗方法研究的靶分子。为进一步探讨大肠癌基因治疗方法，该文利用之前已构建的能同时表达ODC和AdoMetDC的重组腺病毒表达载体Ad-ODC-AdoMetDCas，体外证明其能通过抑制ODC和AdoMetDC的基因表达，使细胞周期阻滞于G1期，从而抑制大肠癌细胞的增殖。进一步分子机理研究证明Ad-ODC-AdoMetDCas可能是通过抑制cyclin D1启动子活性，使cyclin D1基因表达下降，并使cyclin D1上游调节蛋白β-catenin核聚集下调而使细胞增殖停滞于G1期，为探讨结直肠肿瘤的发病机理及其基因治疗方法提供了理论依据。