目的:先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia,CDH)作为一种常见的胎儿先天性结构异常,其发病率约为1/3000。疾病主要特点为:孕期胎儿膈肌发育缺陷从而导致腹腔脏器疝入胸腔对肺组织造成压迫。目前,CDH的病因并不明确,受到基因和环境的共同影响。随着产前诊断技术的不断进步,孕期胎儿超声能够对绝大多数先天性膈疝进行诊断,胎儿磁共振的开展同时能够进行补充明确诊断。CDH可以根据预测/实际肺头比,肝脏是否疝入胸腔,是否合并其它结构异常等预测指标分为轻度和重度膈疝。对于轻度先天性膈疝患儿,其预后相对较好,但是远期的随访中我们发现大多数生存患者仍然存在慢性感染,梗阻性肺部疾病等远期并发症。重度先天性膈疝胎儿的死亡率较高,目前的主要治疗方法为胎儿镜下气管封堵术,但是,胎儿镜的开展面临着更高的胎膜早破、早产风险。因此,对于先天性膈疝的孕期治疗及肺部发育不良的病因机制的研究尤为重要。随着母胎医学的发展以及多学科合作的广泛开展,先天性膈疝胎儿的治疗方案也逐步得到完善。目前,明确诊断的先天性膈疝胎儿通过孕期的严密监测,完善相关检查排除染色体异常后,通过产科、新生儿内外科,麻醉科等相关科室的多学科合作,在分娩期进行子宫外产时处理(EXIT)直接转入新生儿重症监护室进行监测,在新生儿心肺功能稳定能够耐受手术后转入新生儿外科进行膈肌修补术,之后由新生儿内外科共同管理。先天性膈疝治疗的关键是对新生儿呼吸功能的管理。新生儿死亡的原因也主要是因为呼吸系统衰竭,其主要的病因为胎儿肺部发育不良。目前的研究表明,CDH胎儿肺部发育不良不仅是由于腹腔脏器疝入胸腔对发育过程中的肺组织造成压迫,另一个主要原因是先天性膈疝胎儿的整个肺发育过程中的各个阶段可能存在相关调控肺发育分子的异常从而导致肺发育缺陷。因此,明确先天性膈疝胎儿肺发育不良的病因对于提高先天性膈疝新生儿的生存率尤为关键。全外显子测序技术(whole exome sequencing,WES)在胎儿异常产前诊断中的优势逐渐被大家发现。WES能够发现基因水平的异常改变,从而为明确疾病病因和治疗提供证据支持。目前,先天性膈疝患儿的全外显子测序研究并不多,而且主要为国外人群的研究。我们首次选取了国内CDH患儿家系,进行了WES分析,通过数据分析发现了CDH患儿存在肺发育相关基因的异常改变。Ephrin/Eph信号通路作为经典的调控血管发育的关键因子,和调节肺发育的其它关键分子如VEGF等具有复杂的相互调控机制,并且在CDH相关领域没有研究,所以我们选择其作为主要研究基因。Eph受体家族是受体酪氨酸激酶的最大家族。Eph受体家族分为EphA和EphB受体亚家族,EphA受体亚家族通过GPI联接锚定于膜上,而具有跨膜结构域的属于EphB受体亚家族。Eph受体及其配体在神经系统及血管内皮细胞中高度表达,受体分别与相应的Ephrin配体结合后产生双向信号,在胚胎形成、神经轴突导向、突触形成及血管发育中起着关键作用。在血管系统发育过程中EphrinB2/EphB4的作用已经通过基因敲除小鼠模型得到证明,结果提示:EphrinB2/EphB4通过细胞间相互连接发生生物学作用并且在血管形成的过程中是必不可少的,基因敲除能造成小鼠血管系统发育异常、胚胎死亡。Salvucci等的研究表明,EphB2受体及其跨膜配体在体外诱导血管生成的作用与Ang和VEGF的功效类似。经典的调控血管发育的分子一般均参与到肺分支发育的调控,如VEGF。因此,我们推测肺分支发育过程可能受到其调控。在本研究中我们将探讨EFNB2及EPHB4在先天性膈疝大鼠模型中的时空表达变化,以及其调控肺发育的机制,为临床上孕期治疗先天性膈疝提供理论依据。方法:1.选取中国医科大学附属盛京医院分娩的单纯性左侧先天性膈疝患儿家系10例,采集废弃脐带血及胎儿父母外周血,进行全外显子测序分析。通过数据比对、变异识别、变异筛选深层分析,筛选出10例先天性膈疝胎儿的CDH相关变异基因。查阅与肺发育相关的文献,筛选调控肺发育的关键基因。利用STRING在线工具,进行蛋白互作分析。我们发现EFNB2及EPHB4参与调控上皮细胞发生,并且和存在异常的VEGF和ANGPT1基因具有紧密的联系,因此,我们推测其可能在调控肺发育的过程中起到了关键的作用。2.先天性膈疝大鼠模型的构建及胎鼠肺组织发育异常的观察:将受孕雌鼠随机分为两组:实验组(先天性膈疝组,CDH组)和对照组。在E8.5天,实验组雌鼠给予100mg除草醚灌胃处理(100mg除草醚溶于1ml食用油中),对照组雌鼠给予等量食用油灌胃处理。在孕21.5天,对雌鼠采用1%戊巴比妥钠液(40mg/kg)腹腔注射麻醉,取出孕鼠子宫,解剖胎鼠,可见胎鼠膈肌发育缺陷,腹腔脏器(肝脏、胃泡)疝入胸腔。计算膈肌发育缺陷胎鼠数目及胎鼠总数量。首先,进行先天性膈疝胎鼠肺发育不良大体观察。然后取E21.5天胎鼠及其肺组织,无菌纱布擦干羊水等其它组织,电子天平上称重并记录,计算肺指数。E21.5天胎鼠肺组织进行HE染色后计算对照组和先天性膈疝组平均肺泡数和平均线性截距。体外培养E13.5天胎鼠肺组织,培养96h后,观察并计算两组肺组织终末分支数,面积和周长。3.取E13.5、E15.5、E17.5、E19.5、E21.5天胎鼠肺组织,通过Real-Time PCR、Western-Blotting、免疫组化技术检测不同肺发育阶段EFNB2及EPHB4的时空表达变化及在肺组织中的表达位置。4.取E13.5、E15.5、E17.5、E19.5、E21.5天胎鼠肺组织,通过Western-Blotting技术检测不同肺组织发育阶段ERK磷酸化水平。体外培养E13.5天胎鼠肺组织,分为CDH组和CDH+EFNB2组,培养96h后,计算并比较两组肺组织终末分支数,面积及周长。利用Western-Blotting技术检测培养96h后,两组肺组织中ERK,P38,JNK,STAT3的磷酸化水平变化。结果:1.通过STRING分析,我们发现IGF1R,VEGFA,ANGPT1,MMP-2,EFNB2,WNT11,GLI3及EPHB4等相关基因和先天性膈疝肺组织及上皮细胞发育密切相关,且这些关键分子之间具有复杂的调控机制。根据文献报道,我们选择了EFNB2及其受体EPHB4作为研究对象。2.本研究中给予除草醚诱导畸形孕鼠共53只,胎鼠398只,其中给药畸形共261只。致畸率为:65.58%。符合文献报道致畸率。建模成功。先天性膈疝组畸形胎鼠肺组织明显受到压迫,体积小于正常肺组织,并且肺指数、平均肺泡数和平均线性截距低于对照组。体外培养E13.5天胎鼠肺组织,在E13.5天及培养96h后,先天性膈疝组的肺组织发育持续落后于对照组,肺终末分支数目,周长及面积均小于对照组。3.在E13.5和E15.5天(肺组织发育的胚胎期和假腺期),EFNB2和EPHB4的mRNA水平和对照组未见明显差异;随着肺组织发育,在E17.5、E19.5、E21.5天(肺组织发育的小管期和囊泡期/肺泡期)EFNB2和EPHB4在先天性膈疝组相比对照组呈现高表达趋势。在E13.5和E15.5天,EFNB2的蛋白水平和对照组也未见明显差异;随着肺组织发育,在E17.5、E19.5、E21.5天先天性膈疝组EFNB2蛋白表达水平高于对照组。对于EPHB4,在E13.5天,两组比较未见明显差异;随着肺组织继续发育,在其它发育阶段EPHB4的蛋白水平在先天性膈疝组均呈现高表达。4.在EFNB2调控肺组织分支发育的机制的研究中,我们发现E17.5及E21.5天(肺组织发育的小管期和囊泡/肺泡期),先天性膈疝组pERK的表达水平低于对照组。体外培养E13.5天肺组织至96h,CDH+EFNB2组的肺组织发育优于对照组,表现为终末分支数目增多,面积增大,周长增加。检测其相关信号通路分子,我们发现,给予外源性EFNB2重组蛋白组的肺组织中,ERK,P38,JNK,STAT3的磷酸化水平明显降低。结论:1.先天性膈疝胎儿存在肺部发育相关基因突变可能导致肺发育不良;2.EFNB2/EPHB4在先天性膈疝胎鼠肺发育的小管期及囊泡/肺泡期呈现高表达,并且主要表达在上皮细胞中。3.EFNB2能够通过MAPK及STAT3信号通路促进先天性膈疝胎鼠肺组织分支发育。