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背景及目的: 脑血管疾病是威胁人类健康的常见疾病之一，一直受到众多科研和临床工作者的高度重视。脑血管疾病主要分为出血性脑中风和缺血性脑中风，其中缺血性约占85％。血脑屏障由脑微血管内皮细胞，星形胶质细胞终足，周细胞和基底膜组成，其中内皮细胞构成的紧密连接是血脑屏障的主要结构，通过调节细胞旁通透性维持细胞内外环境稳定，具有保护大脑免受潜在神经毒性物质毒害的作用。碱性成纤维生长因子(bFGF)能够维持大脑内血管的完整性，促进脑内血管再生，已有文献报道bFGF在缺血性脑卒中发生时对血脑屏障具有修复作用，但是其具体作用机制的研究尚未清晰。本文旨在阐述外源性bFGF对缺血性脑卒中后血脑屏障损伤的修复作用及其机制研究。 方法: 1.大鼠大脑中动脉栓塞模型的建立 大鼠称重，腹腔注射麻醉，仰卧位固定在手术台上，热灯加热维持体温。剃去颈部毛发，碘酒消毒。颈部正中剪开皮肤，钝性分离皮下组织至气管前肌后，沿右侧找到胸锁乳突肌肌腱，向下分离找到颈内动脉鞘，依次分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。在颈总动脉距分叉处2-3mm处虚系一根细线，远离分叉端结扎颈总动脉。动脉夹夹闭颈外、颈内动脉，在颈总动脉距分叉4-5mm处，将颈总动脉剪开一个45°的小口。由颈总动脉开口处插入栓线，稍微系紧虚系在颈总动脉上的细线，松开颈内动脉的动脉夹，靠中心方向往颈内动脉插入栓线，约18.5±0.50 mm至大脑中动脉起始部。结扎虚系的线，系牢，松开颈外动脉的动脉夹，缝合肌肉皮肤，2小时后拔出栓线至颈总动脉近分叉结扎处，剪去栓线。缺血后立即腹腔注射bFGF溶液(2μg/mL)，清醒后Longa神经学功能评分验证造模成功与否，再灌注24h后NSS神经学功能评分、TTC染色观察梗死面积、伊文思蓝法(Evens blue extravasation)观察BBB通透性。造模24h后，WesternBlot检测紧密连接蛋白(Claudin-5、Occludin、ZO-1)、粘附蛋白(p120-catenin、β-catenin)、新生血管标记蛋白CD31等相关蛋白表达情况。冰冻切片免疫荧光组织化学法检测在MCAO模型中bFGF给药后ZO-1，CD31，Claudin-5的表达变化。 2.人脑微血管内皮细胞糖氧剥夺模型的建立 使用37℃，5％ CO2恒温培养箱培养人脑微血管内皮细胞(HBMECs)，使用内皮细胞完全培养基，培养至约60％的细胞紧密相连。饥饿培养基培养12h后，换用无血清培养基，其中bFGF给药组加入bFGF，然后移至低氧培养箱（氧浓度为0.5％）中培养24h，24h后移至正常培养箱中复氧12h。造模结束后，首先在细胞加入FITC-dextran检测细胞通透性。随后到时间点后收集细胞蛋白，检测紧密连接蛋白(Claudin-5、Occludin、ZO-1)、粘附蛋白(p120-catenin、β-catenin)、新生血管标记蛋白CD31、p-Akt、GTP-Rac1、GTP-RhoA等相关蛋白表达情况。 结果: 1.MCAO造成大鼠的缺血性脑损伤，破坏大鼠的血脑屏障，导致大鼠的神经学功能受损，大脑中动脉供血区周围的伊文思蓝含量明显增加。缺血后立即腹腔注射bFGF，2h后进行再灌注，再灌注24h后进行下述检测。TTC染色及伊文思蓝染色显示bFGF减少MCAO后大鼠大脑的脑梗死面积，减轻MCAO后大鼠血脑屏障的损伤。行为学评分显示bFGF减轻MCAO后神经学功能缺损。免疫荧光结果显示bFGF能减少MCAO后ZO-1，CD31，Claudin-5表达量的下降。Westernblot检测血脑屏障相关蛋白的表达情况，结果显示bFGF能抑制MCAO后紧密连接蛋白（Claudin-5、Occludin、ZO-1）和粘附蛋白(p120-catenin、β-catenin)表达量的降低，表明大鼠血脑屏障得到修复，bFGF对缺血性脑卒中后的血脑屏障具有保护作用。在体外实验中，我们模拟体内脑缺血损伤建立HBMECs的OGD模型，发现bFGF能减少FITC-dextran渗透量增加，即减少OGD后细胞间通透性的升高;此外，bFGF能抑制OGD后细胞紧密连接相关蛋白表达量的减少。 2.在上述结果的基础上，再结合文献报道，我们做了进一步的体外实验，探讨bFGF对缺血性脑卒中后血脑屏障的保护机制。发现在HBMECs中bFGF能上调PI3K/Akt信号通路的表达。为进一步探讨，我们引入了PI3K/Akt通路抑制剂LY294002，结果显示当此信号通路被阻断时，bFGF对紧密连接相关蛋白的保护作用被部分抑制。此外，为确定Rac1在整个实验中的重要性，引入Racl siRNA抑制Rac1活化，抑制了bFGF对血脑屏障的保护作用。因此，我们得出结论bFGF对血脑屏障的保护作用是通过激活PI3K/Akt/Racl信号通路得以实现的。 结论: bFGF能够促进MCAO大鼠及HBMECs中血脑屏障的损伤修复，促进紧密连接相关蛋白表达量的增加，其修复作用可以通过外源性bFGF激活PI3K/Akt/Rac1信号通路抑制RhoA的活性，进而保护缺血后血脑屏障的完整性。