论文部分内容阅读
背景:化疗药物所诱导的心脏毒性是造成癌症患者死亡的一个非常重要的因素,针对其机制及相关保护剂的研究日益增多。顺氯氨铂——简称顺铂（CDDP）,是一种用于治疗多种实体瘤的化疗药物,如宫颈癌、肺癌、睾丸癌等。由于其在治疗过程中存在着严重的心脏毒性作用,使其临床应用受到了很大程度的限制。槲皮素是一类多羟基黄酮类化合物,其具有强抗氧化以及抗炎等作用,存在于多种水果、蔬菜和植物中。其药理学作用十分广泛,在心血管疾病中亦发挥着重要的保护作用。目前有大量研究集中于槲皮素对心脏保护的作用机制,而其具体的作用机制尚在探索之中。目的:基于网络药理学研究槲皮素治疗化疗药物所致心脏毒性的作用机制,初步探究槲皮素对CDDP所诱导的心脏毒性的保护作用及潜在机制。方法:（1）应用Drug Bank、TCMSP和STITCH数据库预测槲皮素作用靶点,通过Gen Cards、Dis Ge NET、GENCLIP和OMIM数据库检索心脏毒性相关靶点,通过HMDD数据库得到心脏毒性相关miRNAs,通过miRTar Base数据库预测相关miRNAs靶点。将槲皮素靶点和心脏毒性相关靶点取交集,筛选得到槲皮素-心脏毒性共同靶点,再将槲皮素-心脏毒性共同靶蛋白与miRNAs靶点取交集,得到槲皮素-心脏毒性-心脏毒性相关miRNAs共同靶点。（2）借助STRING平台构建槲皮素-心脏毒性-心脏毒性相关miRNAs共同靶点PPI网络,利用Cytoscape软件可视化槲皮素-心脏毒性-心脏毒性miRNAs共同靶蛋白网络。（3）利用DAVID数据库对槲皮素心脏毒性-心脏毒性相关miRNAs共同靶点进行GO生物学过程和KEGG富集分析,从而分析槲皮素治疗心脏毒性相关靶点的基因功能及代谢通路。（4）培养大鼠H9C2心肌细胞,以不同浓度的CDDP和不同浓度的槲皮素干预细胞,CCK8法检测各组H9C2心肌细胞的生长情况。具体分组如下:a.对照组:正常培养细胞24h;b.CDDP模型组:2.5,5,10,20,40μM的CDDP处理细胞24h;c.槲皮素模型组:10,20,40,80,160μM的槲皮素处理细胞4h。（5）培养大鼠H9C2心肌细胞,以20μM CDDP和不同浓度的槲皮素细胞,CCK8法检测各组H9C2心肌细胞的生长情况,DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内ROS的水平,JC-1染色检测各组细胞的线粒体膜电位,q RT-PCR检测Nrf-2和HO-1 m RNA的表达,ELISA法检测炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放。具体分组如下:a.对照组:正常培养细胞24h;b.CDDP模型组:20μM的CDDP处理细胞24h;c.槲皮素低剂量组:20μM的槲皮素预处理细胞4h+20μM的CDDP处理细胞24h;d.槲皮素中剂量组:40μM的槲皮素预处理细胞4h+20μM的CDDP处理细胞24h;e.槲皮素高剂量组:80μM的槲皮素预处理细胞4h+20μM的CDDP处理细胞24h结果:（1）经相关数据库预测得到:槲皮素的作用靶点共180个,心脏毒性相关靶点458个,心脏毒性相关miRNA 15个,取交集得到槲皮素-心脏毒性共同靶点68个,再次取交集得到槲皮素-心脏毒性-心脏毒性相关miRNAs共同靶点36个。（2）PPI网络分析显示:槲皮素-心脏毒性-心脏毒性miRNAs靶蛋白PPI网络中有50个节点、445条相互作用连线。筛选出度值高、介数大的关键靶蛋白共有7个,分别为AKT1、TP53、CASP3、MYC、MAPK1、EGFR和HSP90AA1。（3）GO生物学过程和KEGG通路富集分析结果得到:槲皮素—心脏毒性-心脏毒性相关miRNA共同靶点主要参与的具有显著意义（p<0.05）的生物学过程227条,其中与心脏毒性显著相关、基因数目较多的生物学过程有一氧化氮生物合成过程的正向调控,凋亡的负向调控,基因表达的正向调控,RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控和药物反应等;KEGG信号通路87条（p<0.05）,其中与心脏毒性显著相关、基因数目较多的通路有HIF-1信号通路,TNF信号通路,PI3KAkt信号通路,凋亡和雌激素信号通路等。（4）CCK8的检测结果显示:槲皮素能减轻CDDP所诱导的H9C2心肌细胞的细胞毒性,而槲皮素本身对细胞无显著影响;（5）DCFH-DA荧光探针检测结果显示:槲皮素能减少CDDP诱导的H9C2心肌细胞ROS的产生;（6）JC-1染色检测结果显示:槲皮素改善CDDP诱导的H9C2心肌细胞线粒体膜电位的降低;（7）q RT-PCR检测结果显示:槲皮素能提高Nrf2/HO-1m RNA的表达水平;（8）ELISA检测结果显示:槲皮素能够显著降低CDDP诱导的H9C2心肌细胞炎性因子IL-1β的释放。结论:（1）基于网络药理学研究,初步揭示了槲皮素防治心脏毒性的多维调控网络,为进一步研究槲皮素药理学机制提供了参考依据,其后续临床应用提供了研究方向和理论依据。（2）槲皮素能够通过抑制顺铂诱导的心肌细胞氧化应激、线粒体损伤和炎症从而降低心脏毒性。