论文部分内容阅读
研究目的: 用基于超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)的代谢组学方法来分析研究D-半乳糖胺(D-GalN)诱导的急性肝衰竭猪与正常对照组猪的血清代谢物谱差异。探讨在急性肝衰竭(ALF)过程中内源性代谢物的变化模式，鉴定急性肝衰竭的生物标志物，评估D-半乳糖胺诱导的急性肝衰竭对血清代谢谱的影响，从代谢组学角度深入揭示急性肝衰竭的分子发病机制。 研究方法: 1.实验动物:中国实验用小型猪12头，雄性，体重10～12Kg，购自北京农业大学。 2.肝衰竭模型的制造:12只实验用小型猪，随机分为两组:肝衰竭模型组(n=6)和健康对照组(n=6)。手术前12小时禁水、禁食。经颈静脉插管，术中严格无菌操作。手术24小时后，肝衰竭模型组经颈静脉给予D-半乳糖胺（1.5g/kg），空白对照组经颈静脉注射给予等量生理盐水。在整个处理过程中严密观察动物的运动、进食和精神状态等一般情况。 3.样本收集:造模18小时后，所有动物经颈静脉采血，血清离心后-80℃保存。同时在上述时间点收集两组猪的肝脏组织。生理盐水控制组猪的肝脏组织作为健康对照。 4.样品的制备与检测:测试前，所有血清样本在4℃下解冻、融化，200μl上清液与600μl冷乙腈混合（体积比1∶3），高速离心沉淀蛋白质。600μl上清转移到UPLC专用的玻璃瓶中等待检测。质量控制(QC)样本由每个样本30μL混合而成。开始检测样本之前，连续检测QC样本5次，若仪器重复性好，稳定性高，则开始检测目的样本。在整个分析过程中每检测4个目的样本检测一次QC样本。 5.数据处理:用MassLynx v4.1等软件对UPLC-MS检测分析得到的原始数据进行预处理。将数据预处理得到的三维矩阵表导入到SIMCA-P12.0(Umetrics，Umea，瑞典)软件进行多元数据分析。 6.生物标志物的鉴定:基于对健康对照组和肝衰竭模型组的多元数据分析，获得在偏最小二乘法(OPLS)模型中VIP值大于1并且配对t检验P值小于0.05的变量，即在急性肝衰竭过程中变化明显的物质。然后对选取的物质进行鉴定。 研究结果: 1.临床表现、生化结果以及肝脏病理改变: 临床表现:给予D-半乳糖胺后，可以观察到急性肝衰竭组的所有动物都出现食欲减退、拒食、倦怠、反应迟钝、站立不稳、精神萎靡和嗜睡等表现。健康对照组无异常。 生化结果表明:在急性肝衰竭组除了谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)迅速升高外，总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TB)和肌酐(Cr)含量也显著升高，而白蛋白(ALB)、总胆固醇(CHO)及纤维蛋白原(FIB)含量则明显下降。 肝脏病理改变:与健康对照组猪的肝组织相比，急性肝衰竭组猪的肝组织表现为肝细胞大片坏死，肝窦充血和淋巴细胞侵润。 2.UPLC-MS检测结果重复性和稳定性: QC样本的重叠图中可见色谱峰紧密重叠，保留时间稳定，无明显漂移。在PCA得分图中QC样本聚类亦良好，并且已经鉴定的生物标志物在QC样本中变异系数较小，表明本研究的UPLC-MS对血清的检测具有良好的重复性和较高的稳定性。 3.多变量数据分析结果: 结果显示不论是无监督的主成分分析(PCA)还是有监督的偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法(OPLS)分析，急性肝衰竭模型组与健康对照组均有明显的分组趋势且两组标本都具有较好的聚集性。说明经颈静脉注射D-半乳糖胺后，肝衰竭模型组猪的血清代谢物与正常对照组相比发生了明显的变化，猪的正常生理代谢被干扰。 4.生物标记物的鉴定: 基于以上对健康对照组和急性肝衰竭模型组的模式识别分析，我们选择了在OPLS模型中VIP值大于1并且配对t检验P值小于0.01的变量，即在急性肝衰竭过程中含量明显变化的物质。通过搜索HMDB、PubChem和KEGG数据库以及与本实验室建立的代谢物的标准MS/MS谱图比较，我们鉴定了4类共40个物质。这四类物质依次为胆汁酸类、溶血卵磷脂类(LPCs)、卵磷脂类(PCs)和脂肪酰胺类(FAAs)。 研究结论: 本研究应用超高效液相色谱质谱(UPLC-MS)的检测技术结合多变量数据分析方法，探索了D-半乳糖胺诱导的猪急性肝衰竭过程中血清代谢产物的变化，并鉴定了4类生物标志物:结合型胆汁酸类，溶血卵磷脂类(LPCs)，卵磷脂类(PCs)和脂肪酰胺类（FAAs）。研究表明，溶血卵磷脂类(LPCs)、卵磷脂类(PCs)和脂肪酰胺类(FAAs)在急性肝衰竭模型组的相对含量大幅下降，而胆汁酸类如GUDCA(甘氨熊脱氧胆酸)、TUDCA(牛黄熊脱氧胆酸)、GCDCA(甘氨鹅脱氧胆酸)的含量则明显升高。