【摘 要】
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在详细分析TNF的分子结构与功能的关系和有关TNF衍生物的研究报道后,该研究应用PCR、定点突变等技术,设计人工引物,以天然的人TNF-α cDNA为模板, 扩增出三种TNF的突变物,将
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在详细分析TNF的分子结构与功能的关系和有关TNF衍生物的研究报道后,该研究应用PCR、定点突变等技术,设计人工引物,以天然的人TNF-α cDNA为模板, 扩增出三种TNF的突变物,将其分别克隆至原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌宿主菌,进行温度诱导表达,表达的重组目的蛋白约占菌体总总蛋白的25%,主要以可溶性形式存在于表达工程菌的超声上清中.采用结晶紫染色测定法检测各种TNF突变体对L929细胞的细胞毒活性并检测其致死毒性.实验结果表明,TNF突变休mT<,1>的LD50(mg/kg体重)与野生型TNF(wT)相当,但是其细胞毒活性比wT显著升高,它们的比活分别为1.46×10<8>U/mg和1.41×10<6>U/mg;mT<,1>对某些人肿瘤细胞株的杀伤作用也明显高于wT,而且对体内移植肿瘤组织的出血坏死效应也较wT显著增强.mT<,2>m<,3>的LD50(mg/kg体重)均低于wT,而且它们的细胞毒活性也明显下降.选择细胞毒活性升高的mT<,1>进行盐析、色谱层析等系列分离纯化,纯度达95/100以上,比活达3.94×10<9>U/mg.
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