囊礁膜硫酸多糖及其寡糖的结构研究

来源 :中国海洋大学 | 被引量 : 11次 | 上传用户:junjiec
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绿藻门石莼目中的绿藻多糖大多数为硫酸化多糖,其生物活性具有多样性,如抗凝血活性、抗氧化性、调血脂、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用等,硫酸化多糖的结构研究是硫酸化多糖开发与应用的理论基础。本论文以绿藻门石莼目礁膜属的囊礁膜为研究对象,采用各种色谱分离技术,获得囊礁膜硫酸多糖,采用化学和现代波谱方法对其结构进行研究。研究结果如下:1囊礁膜藻粉经冷水、热水提取,得到冷水提多糖CMK和热水提多糖HMK,其得率分别为27.28%和19.62%,通过离子交换色谱和凝胶渗透色谱纯化,主要得到三种多糖CMKS-1、CMKS-2和HMKS,经过脱硫反应得到相应的脱硫多糖dsCMKS-1、dsCMKS-2和dsHMKS。采用柱前PMP衍生高效液相色谱检测各个多糖组分的单糖组成,结果表明CMKS-1、CMKS-2和HMKS含有73.64~78.84%的鼠李糖,CMKS-1和CMKS-2葡萄糖含量(10.74~13.77%)高于HMKS(约4.73%),另外,三种多糖还含有少量葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖及甘露糖;通过红外光谱法可知三种水溶性多糖均含有硫酸基的特征吸收峰;通过化学方法对总糖含量、硫酸基含量及蛋白质含量进行测定,结果表明,多糖CMKS-1、CMKS-2和HMKS的总糖含量分别为54.21%、51.16%和54.33%,硫酸基含量为23.86%、22.52%和25.84%,蛋白质含量较低。通过高效凝胶渗透色谱法测得多糖CMKS-1、CMKS-2和HMKS的分子量分别为283.8kDa、73.5kDa和926.5kDa。通过甲基化分析和核磁共振波谱(1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13CHMQC、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、1H-1HNOESY)等技术对多糖结构进行解析,多糖dsHMKS由二糖单元[α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→、[α-L-Rhap(1→2)-α-L-Rhap(1→]、[→3)-α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→][→2)-α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→]和[→2)-α-L-Rhap(1→2)-α-L-Rhap(1→]或连续或交替重复排列构成的,并以糖基片段[→3)-α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→]为主;CMKS-1和CMKS-2的结构极为相似,主要由糖基片段[→3)-α-L-Rhap(1→]和[→2)-α-L-Rhap(1→]组成,并且硫酸基团主要位于[→3)-α-L-Rhap(1→]的C-2位羟基和[→2)-α-L-Rhap(1→]的C-3位羟基上,非还原末端鼠李糖[α-L-Rhap(1→]的C-2、C-3、C-4位羟基也可被硫酸酯化。2采用三氟乙酸降解法对多糖HMKS进行降解,在不同的酸浓度(0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L)以及不同温度(60℃、80℃、100℃)反应条件下得到分子量858.58~1.28kDa之间的27种多糖组分。通过甲基化与1H NMR,13C NMR,1H-1H COSY,1H-13C HMQC,1H-13C HMBC等技术对分子量约为16.51kDa的低分子量多糖QSA的结构进行解析,发现其以[→3)-α-L-Rhap(1→]鼠李糖为主,并含有[→3)-α-L-Rhap(2SO2-4)(1→]、[→2)-α-L-Rhap(3SO2-4)(1→]、[→2)-α-L-Rhap(1→]、[→2,3)-α-L-Rhap(1→],以及少量的[→2)-α-L-Rhap(4SO2-4)(1→]鼠李糖等结构片段,其非还原末端鼠李糖环上的游离羟基均可被硫酸酯化,并推测其可能含有硫酸酯化的葡萄糖。3以多糖HMKS为原料采用三氟乙酸降解获得囊礁膜寡糖片段,通过凝胶渗透色谱分离纯化,得到不同聚合度的寡糖组分,并通过TLC、甲基化分析、ESI-MS对寡糖组分的纯度、糖苷键的连接方式、聚合度以及结构进行了分析。通过甲基化分析与负离子模式下二级质谱ESI-CID-MS/MS分析了聚合度为2~4的单硫酸化寡糖的结构,并确定了硫酸化鼠李单糖中糖环C-3位羟基硫酸酯化,硫酸化鼠李二糖的结构为α-L-Rhap(3SO4)-(1→3)-α-L-Rhap和α-L-Rhap(2SO4)-(1→3)-α-L-Rhap两种连接方式组成,硫酸化鼠李糖-葡萄糖醛酸二糖的结构为α-L-Rhap(3SO4)-(1→4)-β-D-GlcAp、α-L-Rhap(2SO4)-(1→4)-β-D-GlcAp、 β-D-GlcAp(4SO4)-(1→3)-α-L-Rhap和β-D-GlcAp(4SO4)-(1→2)-α-L-Rhap四种连接方式,并且推出聚合度3~4的单硫酸酯化的寡糖的结构,以及含糖醛酸的鼠李寡糖的结构。本论文的研究成果,对囊礁膜硫酸化多糖的生物学活性研究与开发、“海洋糖库”的建设以及发展具有我国特色的海洋药物具有重要的学术价值和经济意义。
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