论文部分内容阅读
(S)-雌马酚((S)-equol)是豆类食品在肠道内经特定微生物代谢后产生的一种高度稳定小分子化合物，并与雌激素的结构和功能高度相似，能与β-雌激素(ER-β)受体结合。具有防治更年期综合症、心血管疾病和多种雌素依赖性癌症的功能。目前雌马酚的生产多为工业化学合成，具有产率低，中间产物多，成本高等缺点。 已有研究从肠道乳酸菌中鉴定出了产雌马酚相关基因簇。本学位论文通过人工合成来源于乳酸杆菌20-92具有转化大豆素(Daidzein，DZ)成（S)-雌马酚能力的基因:ddrc、dznr、dhdr、thdr和来源于土壤微生物中具有水解葡萄糖苷键能力的bgl基因，并分别克隆至大肠杆菌兼容载体，获得以下质粒pETDuet-1-L-ddrc-dznr、pCDFDuet-1-L-dhdr-thdr和pRSFDuet-1-bgl。将这些质粒转入大肠杆菌宿主菌，验证其利用大豆苷(Daidzin，Di)和大豆素生产(S)-雌马酚的能力。通过PFAC海洋转座子文库筛选具有(S)-雌马酚耐受的大肠杆菌突变株，并通过克隆和过表达的方法验证本研究鉴定到的雌马酚耐受基因。本研究拟采用微生物发酵法实现(S)-雌马酚高效生产，旨在为弥补工业生产雌马酚的不足。主要研究结果如下: (1)pETDuet-1-L-ddrc-dznr和pCDFDuet-1-L-dhdr-thdr共转化入大肠杆菌后可以将大豆素转化为(S)-雌马酚。PRSF-bgl转化入大肠杆菌后具有将大豆苷和豆粕转化成大豆素的能力。 (2)筛选获得了一株可以耐(S)-雌马酚的大肠杆菌突变株BL21(ydiS)，测序发现PFAC(ydiS)可能与雌马酚耐受相关，体外克隆表达进一步验证PFAC(ydiS)的诱导表达可以抵抗(S)-雌马酚对大肠杆菌的抑制作用。 (3)将pETDuet-1-L-ddrc-dznr、pCDFDuet-1-L-dhdr-thdr和PRSF-bgl三个质粒共转化入大肠杆菌后并不能直接利用大豆苷生产雌马酚，但分步发酵法以PRSF-bgl转化大豆苷或豆粕的大豆素为底物，含有pETDuet-1-L-ddrc-dznr和pCDFDuet-1-L-dhdr-thdr质粒的大肠杆菌可以生产(S)-雌马酚。