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目的:检测伴放线聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)野生型和突变型细胞致死性扩张毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)导致Jurkat细胞凋亡的作用,探寻CDT诱导Jurkat细胞凋亡过程中的关键信号通路。方法:将野生型cdt A、cdt B、cdt C及突变型cdt B基因(R117A、H160A、D199S、H274A四个氨基酸活性位点同时突变)通过p ET-15b质粒扩增,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白表达。Ni-His Trap HP预装柱对各重组蛋白进行体外纯化,通过Bandscan软件检测纯化后各亚基蛋白的纯度。纯化复性后的野生型和突变型Cdt B与超螺旋质粒p ET-32a孵育,通过1%琼脂糖凝胶电泳观察反应后的情况,验证其I型DNA酶(Deoxyribonuclease I,DNase I)生物学活性;同时与Jurkat细胞共孵育后通过ELISA检测细胞膜上剩余3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4,5-triphosphate,PIP3)的含量,观察其PIP3酶活性,由此判定重组Cdt B蛋白是否具有生物学活性。Cdt A、Cdt B和Cdt C在体外重构成全毒素后用分子筛层析质谱技术检测是否重构成功。将全毒素CDT与Jurkat细胞共孵育24h,透射电镜观察Jurkat细胞凋亡的形态学改变;使用Annexin V/PI染色方法,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测Jurkat细胞的凋亡情况;同时通过Western blot技术检测Bcl-2/Bax的表达改变情况。通过i TRAQ技术检测凋亡过程中相关蛋白的表达情况,筛选可能的信号通路,通过Western blot验证i TRAQ芯片结果。结果:Cdt A、Cdt B(野生型和突变型)和Cdt C蛋白均成功表达,经纯化后纯度都可达80%以上。野生型的Cdt B蛋白可以导致超螺旋质粒p ET-32a DNA解螺旋,可以水解细胞膜上的PIP3,而突变型的Cdt B蛋白不具备这些功能。分子筛层析法检测证实野生型和突变型CDT全毒素均正确进行体外重构。流式细胞仪结果显示野生型CDT可引起50.54%的细胞发生凋亡作用,显著高于对照组(4.71%)和突变组(5.58%)(p<0.05);透射电镜和激光共聚焦扫描电镜结果均可见野生型CDT作用后的细胞呈现典型的凋亡形态;野生型CDT处理的细胞中Bax表达升高,而Bcl-2表达降低。i TRAQ检测发现17个凋亡蛋白表达发生改变,其中10个蛋白(SMNDC1、TNFRSF10B、UBE2I、ITM2A、CASP3、P53、EIF1、TCF3、HMGN5、CASP8)表达升高,7个蛋白(RRM2、TPX2、KIF11、NUCKS1、TOP2A、XRCC1、PTPLAD1、RRM2)表达下降。筛选得出可能存在的通路为Ubc9/P53/DR5/Caspase-8/Caspase-3,Western blot结果显示蛋白表达情况与蛋白组学结果一致,相关验证工作正在进行中。结论:成功获得野生型Cdt A、Cdt B、Cdt C和突变型Cdt B亚基,以及具有生物学活性的CDT全毒素。野生型Cdt B具有DNase I和PIP3酶活性,野生型CDT全毒素可引起Jurkat细胞发生显著的凋亡。蛋白组学技术检测获得了A.actinomycetemcomitans CDT诱导Jurkat细胞凋亡的相关蛋白,筛选出了可能的信号通路,为进一步研究CDT介导的致病机制奠定了基础,同时有望为临床诊断和治疗局限型侵袭性牙周炎(localized aggressive periodontitis,LAg P)提供新的方法。