研究背景与目的丙型肝炎病毒（HCV）感染所致丙型肝炎是慢性肝病及肝细胞癌（HCC）的原因之一；但迄今尚无疫苗和特异有效的治疗方式。深入研究丙型肝炎病毒的感染与致病机制具有重大的现实意义。我们在通过对过表达丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的肝癌细胞系进行抑制性消减杂交筛选，分析其基因表达谱的差异表达基因时发现了一个与支链氨基酸代谢密切相关的一个基因NS5ATP1。该蛋白的主要分布于线粒体，为分解缬氨酸的一个重要的酶。但是现有的研究资料非常有限，且现有研究都是通过从动物体内分离获得该蛋白。所以，我们希望能够通过基因重组的分子生物学方法获得该蛋白，并制备其抗体，然后通过免疫组化调查、过表达对细胞和组织的影响等方面对NS5ATP1进行初步的生物学功能探索。方法为了能够进行NS5ATP1的生物学功能分析，我们从以下内容逐步进行实验：1．原核表达纯化NS5ATP1蛋白：构建原核表达载体pET-32a-NS5ATP1，转化BL21宿主菌后经IPTG诱导，获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达，并用SDS-PAGE和Westernblot对表达蛋白的特异性进行分析和验证，然后利用Ni+亲和柱纯化该表达蛋白。1．制备NS5ATP1蛋白的兔多克隆抗血清将纯化好的NS5ATP1纯蛋白免疫新西兰兔，获得抗NS5ATP1多克隆抗体。以纯化NS5ATP1蛋白为抗原，利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。2．各种生理病理情况下肝组织的免疫组化调查研究。将兔抗NS5ATP1血清进行免疫组化，优化实验条件。然后分别对正常肝脏、重型肝炎等肝组织进行调查研究。4．分别对CCl4和LPS联合氨基半乳糖诱导的急性大鼠肝衰竭模型进行病理分析。由于临床病理标本中，大部分肝组织的损伤同时存在炎性反应和代谢性损伤。为了区分这两种病理情况下NS5ATP1表达的区别，所以我们建立了CC14诱导的急性中毒性肝损伤和LPS联合氨基半乳糖的炎性肝损伤模型。然后制备病理切片进行免疫组化分析，以调查在不同病理情况下该蛋白表达的差异。5．构建NS5ATP1蛋白的GFP融合表达载体，进行体外的真核细胞表达为了能够直观的观察到NS5ATP1在细胞中的表达及在细胞中表达对细胞的影响，我们通过pEGFP-C1荧光表达载体的多克隆位点设计引物，将NS5ATP1与GFP进行融合表达，并经行Western blot验证，观察该蛋白过表达对细胞的影响。6．NS5ATP1体内过表达对细胞的影响通过高压尾静脉注射，对小鼠体内肝细胞进行转染。冰冻切片观察荧光表达情况，普通石蜡切片进行免疫组化分析蛋白在细胞中的过表达后形态。7．ROS探针分析NS5ATP1过表达细胞中氧化状态将ROS探针加入转染后细胞培养上清，观察细胞内表达GFP-NS5ATP1蛋白时，细胞内的氧化状态。当出现高氧化状态时，细胞核将被染成橘红色。表达GFP—NS5ATP1蛋白的细胞呈绿色，这样我们就可以观察到绿色荧光与红色荧光都标记好的，表达GFP-NS5TP1的高氧化状态的细胞。结果1．NS5ATP1融合蛋白在原核表达系统成功表达。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达，量大，经亲和层析纯化后，我们得到了高纯度的抗原。2．用NS5ATP1融合蛋白免疫新西兰大白兔，成功获得了兔抗NS5ATP1高特异高滴度的多克隆抗体。．3．NS5ATP1在正常肝脏中免疫组化分析为阴性，但是在重型肝炎肝脏组织中的损伤细胞中有高表达。4．CCl4诱导的大鼠损伤模型中NS5ATP1在中央静脉区有高表达，CCl4在诱导的肝细胞损伤中央静脉区肝细胞的特点一致。然而在LPS与氨基半乳糖联合建立的急性肝损伤模型中，只能见到大量的枯否细胞，但没有NS5ATP1的高表达。5．成功构建了GFP-NS5ATP1融合表达载体，并转染肝癌细胞株Bel 7402中观察到，高表该蛋白会引起细胞大量溶解破碎坏死，最后表达荧光的细胞在24 h左右全部因坏死而消失，Hochest染色发现大量的核碎裂。坏死时间高峰在15～19h之间。6．通过高压注射的方法，成功地将该表达载体转染进入了小鼠活体肝脏细胞中。冰冻快速切片能观察到GFP-NS5ATP1的强表达，且与对照组中单纯表达GFP的细胞有明显区别。表达GFP-NS5ATP1强于表达GFP，且表达GFP-NS5ATP1的细胞破碎溶解，细胞外型不完整，呈细胞坏死形态。7．通过ROS探针，分析我们观察到了核被染成红色的高氧化状态细胞均有GFP-NS5ATP1的表达。结论通过实验我们得到了以下观点：①通过原核表达、蛋白纯化，我们得到了高纯度的NS5ATP1蛋白，为抗体的制备打下了基础；②通过将纯化蛋白免疫新西兰大白兔我们得到了高滴度高特异的兔抗NS5ATP1血清，为了进一步的该蛋白功能学研究打下基础；③通过免疫组织化学分析，正常肝脏组织中NS5ATP1为阴性，但是在坏死肝细胞中NS5ATP1却有高表达，所以我们认为在该蛋白与肝细胞受损密切相关，同时由于该蛋白的功能主要是分解支链氨基酸产生能量，所以我们认为该蛋白很有可能是由于肝细胞的能量缺乏，引起代偿性高表达；④NS5ATP1在CCl4诱导的损伤肝细胞中得到了高表达，但是在LPs联合氨基半乳糖诱导肝细胞损伤中没有得到高表达，所以我们认为NS5ATP1在不同的原因造成的肝细胞损伤中的表达是不一致的。NS5ATP1主要表达在中毒性的具有肝细胞代谢障碍的损伤机制中，与炎症诱导的肝细胞凋亡、坏死的机制不一致。结合第③我们认为在重症肝炎中同时存在着不同的肝细胞坏死机制，可能炎性坏死与代谢性损伤同时存在；⑤NS5ATP1高表达在体外能引起肝细胞的坏死，坏死的时间集中在1519 h之间，也是该蛋白在细胞中的高表达时期；⑥通过高压尾静脉注射能够在体内进行转染，得到GFP-NS5ATP1的肝高表达模型，同时体内实验证实了体外实验的结果，即NS5ATP1高表达会引起细胞坏死；⑦NS5ATP1引起的细胞坏死是通过氧化应激的途径进行的。