研究背景Brugada综合征(Brugada Syndrome)自1992年被西班牙学者Brugada两兄弟报道以来,世界各地学者对其的认识程度也不断加深,它是一种以右胸导联ST段抬高为特征,并且经常伴有心脏不同水平的传导延缓,具有发生致命性室性心律失常的潜在风险或者家族史中有猝死病史等为特点的遗传性心律失常疾病。虽然目前已经发现最小的患者为几个月大的婴儿,而最大的患者高达84岁,但大多数典型的Brugada综合征首次发病多发生于患者的30-40岁期间,而男性发病率明显高于女性,是导致青年男子猝死的重要病因。据估计,Brugada综合征占全部猝死病因的4-12%,而在没有器质性心脏病的猝死病例中,Brugada综合征患者比例高达20%。据文献报道,Brugada综合征全球发病率大约为5/10000,有明确临床表现的Brugada综合征在西方国家的发病率为1/5000-10000,东南亚及日本地区发病率为0.12-0.14%。值得一提的是,在东南亚地区,Brugada综合征导致的青年人猝死率仅次于交通事故致死率,而成为该地区年轻男子的第二大“杀手”。近年来,借助当今日新月异迅猛发展的分子生物学、分子遗传学等领域的新技术,世界各地学者针对发生于“健康”人群的猝死患者展开了深入细致的研究,Brugada综合征的神秘面纱已经被学者们逐渐揭开。研究发现,Brugada综合征和先天性QT间期延长综合征(LQTS)一样,是一种编码心脏离子通道蛋白的基因发生异常从而导致的遗传性心律失常疾病,其遗传方式为常染色体显性遗传,但表现型受到多种因素(发热,饮酒,基因多态性等)影响而导致其具有不完全外显的特征。自1998年美国学者Chen等发现了第一个导致BrS发病的相关基因——编码心脏钠离子通道蛋白α亚基的基因(SCN5A)开始,到目前为止,在Brugada综合征患者的SCN5A基因上共发现100余个可能与之发病有关系的点突变,学者们对部分突变已经展开了功能表达研究,确定了它们的致病作用。SCN5A基因位于人类三号染色体上,负责编码心脏电压门控性钠通道蛋白α亚基,该亚基共2016个氨基酸,在细胞膜上形成4个类似的同源结构域(DI-DIV),每个区域由6个跨膜片段(S1-S6)组成,各区连接段在胞内形成一个叫P-Loop的结构,4个区的P-Loop结构形成一个供钠通道流入的孔。研究表明,该基因缺陷影响钠离子通道蛋白的结构和功能,导致瞬时外向钾离子电流(Ito)绝对或相对增强,使得心室肌外层复极1期末切迹加深,心肌细胞进入动作电位平台期后,心内外层复极时同一时间跨壁电压差持续存在导致体表心电图的ST段持续抬高。而Ito离子流强弱程度导致Brugada波呈现不同形态,在Ito离子流较弱时,T波直立,心电图ST段呈现“马鞍形”抬高；反之则出现帐篷样改变伴T波倒置。而同时1期复极末切迹过深使得动作电位2期不但内外层心肌存在跨壁电压差,并且在外层各部分之间存在复极离散,造成2相折返,引发室性心律失常。近些年来,基于对Brugada综合征发病机制研究的越来越清晰化,在各国学者共同努力之下,在针对Brugada综合征的分子遗传学研究方面取得了突飞猛进的成果,不断发现其他几个相关基因,如GPD1-L、SCNlb、SCN3b、CACNAlC、 CACNBβ2b、KCNE3和KCNH2。2011HRS/EHRA新公布的针对遗传性离子通道病的基因检测的专家共识明确指出：目前发现Brugada综合征的致病基因至少牵涉8个基因。SCN5A基因占了基因型阳性的Brugada综合征病例的绝大部分(>75%)。然而,在对那些具有明确临床表现的Brugada综合征患者进行基因检测时,SCN5A基因异常的检出率仅为25%。尚有大部分(>65%)的Brugada综合征患者不能确定其致病基因。这表明,尚有其他基因可能导致出现Brugada综合征,由此看来,目前我们对Brugada综合征致病基因的认识还十分肤浅,仅仅是冰山一角,所以Brugada综合征致病基因研究任重而道远。正因如此,该共识也推荐对确诊为Brugada综合征的患者及其家属进行以SCN5A基因为主兼顾其他基因的全面基因,一方面明确患者的致病位点,另一方面有利于发现尚未报道的新基因位点,为此,美国心、肺、血研究所(NHLBI)和少见病办公室(ORD)于2006年9月也联合召开了专题研讨会议,建议加强遗传性离子通道病的研究,推动科研以期改进遗传性心律失常疾病的诊断和治疗。目前,遗传性心律失常的遗传学研究已经成为当今心律失常学领域的研究热点,它不但能揭示心律失常背后的本质,而且能为临床决策提供强有力的指导证据。目的我们以因不明原因晕厥来南方医院心内科就诊并依据国际通用准则确诊为Brugada综合征的3名患者作为研究对象,建立临床资料,抽取其外周全血样本,提取白细胞中全基因组DNA,以SCN5A基因为候选基因,取用DNA提取产物对其28个外显子部分进行PCR扩增,将产物直接测序分析,明确患者是否携带SCN5A基因变异位点,有助于发现致中国人群发生Brugada综合征新的基因变异位点,进一步明确其致病原因,并结合相关文献探讨其致病机理,丰富我们对中国人群中Brugada综合征发病的分子遗传学的认识。研究对象全部研究对象均来自2009年1月-2011年1月在南方医院心内科就诊并确诊为Brugada综合征的住院患者,3名患者均为男性,年龄32-70岁,3例患者均接受血生化、心肌酶谱、肌钙蛋白、胸片、脑电图、头颅CT及超声心动图等检查,45岁以上患者加行冠脉造影检查,所有患者均有晕厥病史但并未发现明显器质性心脑血管疾病,3例患者心电图均可见Ⅰ型Brugada波改变(V1-3导联至少一个导联呈现完全性右束支传导阻滞并ST段下斜型抬高的“帐篷样”改变,同时伴有T波倒置),患者家族史调查均无阳性发现,心内电生理检查诱发心室颤动。其诊断标准依据2005年ESC发布的有关Brugada综合征的专家共识确立诊断：若在排除其他继发因素(药物、低温、急性前壁心肌梗死等)后,患者自发或经药物诱发出现Ⅰ型Brugada心电图模式的情况下,同时满足下列至少一项条件时,即可诊断为BrS,①、记录到患者出现多形性室性心动过速或心室颤动,②、电生理检查可诱发患者出现上述心律失常,③患者既往有晕厥或夜间濒死样呼吸病史,④家族中有成员出现Ⅰ型Brugada心电图,⑤家族中有成员在45岁以前发生猝死。入选健康体检患者103例作为对照研究组,对照组入选标准为：除不符合Brugda综合征诊断标准外,(1)经病史询问无晕厥、抽搐及室性心律失常等病史,家族中无猝死病史；(2)排除心房纤颤(AF)、扩张性心肌病(DCM)、长QT间期综合征(LQTS)、病窦综合症(SSS)、房室传导阻滞(AVB)及左室致密化不全(LVNC)等已经证实与SCN5A基因异常相关的疾病。以上研究对象均获知情同意。方法用EDTA抗凝管留取各受试对象的全血每人4ml,至于-20℃冰箱内保存,用DNA提取试剂盒针对先证患者的血液样本抽提白细胞全基因组DNA,将所得DNA提取物采用聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增,共设计34对引物,分别扩增SCN5A基因的28个外显子。PCR反应体系如下：采用Platinum(?)Taq反应体系共25uL,除了luL模板DNA,其余24uL的Supermix组成为：10×PCR缓冲液2.5uL,2.5mM dNTP混合液2uL,50mM MgCl20.75uL,5uM上游及下游引物各luL, Platinum(?)Taq DNA聚合酶0.2uL,其余加入灭菌蒸馏水补足体积。上述反应体系的扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸90s,经过35个循环后,再以72℃5min延伸,终末以4℃保存。PCR完成后采用1.5%的琼脂糖进行电泳鉴定,不理想者再对反应体系及条件进行优化,直到达到最佳效果。由invitrogen生物有限公司采用3730XL型DNA测序仪对产物进行直接测序。测序结果应用Chromas软件进行BLAST同源比较,若有碱基改变,在NCBI的SNP数据库中进行查找,看既往是否已经对变异位点进行公布,同时找出是否存在氨基酸序列的改变。若发现存在氨基酸改变,则以同样引物扩增变异点所在外显子,在103个健康者中筛查用以排除遗传多态性可能。结果在3例患者中,除发现一些已经公布的同义多态性位点外,在1号患者的20号外显子上发现导致氨基酸编码改变的碱基替换,该位点由鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A),导致钠通道α亚单位蛋白一级结构的1192位氨基酸密码子由CGG[精氨酸Arg (R)]变为CAG[谷氨酰胺Gln(Q)],在103例健康者体检中发现1例患者携带此变异位点(1例/103例,0.0097),且在NCBI中SCN5A基因SNP数据库中未见公布,但曾有学者在2002年报道,同样变异位点在日本Brugada综合征患者中存在。结论1、中国人Brugada综合征患者编码心脏钠通道蛋白α亚基的SCN5A基因同样存在G3769A变异,与之相应的氨基酸改变为R1192Q；2、Brugada综合征患者存在除SCN5A基因以外的致病基因；