本实验应用膜片钳和免疫印迹技术探讨腺苷类似物CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜钾离子通道活性调节的信号转导机制，进一步揭示肾脏髓袢升支粗段重吸收的机理。结果表明：　　 一、CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道的影响。　　 本实验观察10μmol/L的CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道的影响。在钳制电压为0 mV时，对髓袢升支粗段管周膜进行封接，形成细胞贴附式封接后，记录到50 pS钾离子通道，记录2-3分钟后向浴槽内加入10μmol/L的CHA，观察其对通道开放几率(NPo)的影响。实验结果显示，10μmol/L的CHA能增加50 pS钾离子通道的活性，通道开放几率从0.17±0.05增加到0.38±0.09(n=5，P<0.05)。　　 二、PKA依赖途径在CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道调节中的作用。　　 在PKA抑制剂dihydrochloride(H8，5μmol/L)存在的情况下，钳制电压为0 mV时，形成细胞贴附式封接后，记录到50 pS钾离子通道，记录2-3分钟后向浴槽内加入10μmol/L的CHA，观察其对通道开放几率的影响。结果显示，在H8存在的情况下，10μmol/L的CHA不能明显增加大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道的活性。加药前通道开放的几率是0.22±0.03，加药后的开放几率是0.25±0.05(n=4，P>0.05)。说明H8能完全阻断CHA对50pS钾离子通道的激活作用，所以，CHA对该通道的激活作用是通过PKA依赖途径实现的。　　 在髓袢升支粗段组织中加入10μmol/L的CHA，作用相应的时间后，观察PKA的蛋白表达及其磷酸化水平是否发生改变。实验结果显示，10μmol/L的CHA没有明显改变PKA的蛋白表达(n=3，P>0.05)，但增加了PKA的磷酸化水平(n=4，P<0.01)，而且这种增加具有浓度依赖性，即随着浓度的增加P-PKA的表达亦明显增加，说明CHA能够激活髓袢升支粗段中的蛋白激酶A。　　 在钳制电压为0 mV时，对髓袢升支粗段管周膜进行封接，形成细胞贴附式封接后，记录到50 pS钾离子通道，记录2-3分钟后向浴槽内加入100μmol/L的cAMP类似物DB cAMP(dibutylyl cAMP)，观察其对50 pS钾离子通道开放几率的影响。实验结果显示，100μmol/L的DB cAMP可以明显增加50 pS钾离子通道的活性，加药前通道的开放几率为0.20±0.05，加药后的开放几率是0.44±0.11(n=5，P<0.01)。以上实验结果说明，CHA是通过激活PKA依赖途径来增加髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道活性的。　　 三、PLA2依赖途径在CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道调节中的作用。　　 在PLA2的抑制剂AACOCF3(5μmol/L)存在，钳制电压为0mV时进行封接，形成细胞贴附式封接后，记录到50 pS钾离子通道，记录2-3分钟后向浴槽内加入10μmol/L的CHA，观察其对通道开放几率的影响。实验结果显示，在AACOCF3存在的情况下，CHA不再增加50 pS钾离子通道的活性，加药前的通道开放几率为0.31±0.09，加药后的开放几率为0.34±0.07(n=4，P>0.05)。说明AACOCF3能完全阻断CHA对50 pS钾离子通道的激活作用，所以，CHA对该通道的激活作用也通过PLA2依赖途径。　　 在髓袢升支粗段组织中加入10μmol/L的CHA，作用相应的时间后，观察PLA2的蛋白表达及其磷酸化水平的改变。实验结果显示，在不同的时间点，PLA2的蛋白表达都未发生改变(n=3，P>0.05)，但其磷酸化水平却发生了改变(n=4，P<0.01)，即P-PLA2的蛋白表达下降，而且这种下降亦具有浓度依赖性，即随着CHA浓度的增加，P-PLA2的蛋白表达逐渐下降，说明CHA抑制了髓袢升支粗段中PLA2的活性。　　 在钳制电压为0 mV时，对髓袢升支粗段管周膜进行封接，形成细胞贴附式封接后，记录到50 pS钾离子通道，记录2-3分钟后向浴槽内加入5μmol/L的PLA2抑制剂AACOCF3，观察其对通道开放几率的影响。实验结果显示，5μmol/L的AACOCF3可以明显增加50pS钾离子通道的活性，加药前通道的开放几率为0.21±0.06，加药后的开放几率是0.48±0.15(n=5，P<0.01)。以上实验结果说明CHA也可通过抑制PLA2依赖途径来增加髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道的活性。　　 四、PKA依赖途径和PLA2依赖途径在CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道调节中的相互作用。　　 在髓袢升支粗段组织中先加入PKA的阻断剂H8，作用15min后，再加入10μmol/L的CHA，作用相应的时间后，观察P-PLA2的变化；在髓袢升支粗段组织中先加入PLA2的阻断剂AACOCF3，作用15min后，再加入10μmol/L的CHA，作用相应的时间后，观察P-PKA的变化。实验结果显示，阻断了PLA2以后CHA依旧能够增加P-PKA的蛋白表达(n=4，P<0.01)，但阻断了PKA以后CHA却不再能够降低P-PLA2的蛋白表达，即P-PLA2的蛋白表达未发生改变(n=4，P>0.05)。以上实验结果说明，CHA是通过先激活PKA而后再抑制PLA2，进而增加50 pS钾离子通道的开放几率。　　 结论：　　 一、CHA能增加大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道的活性。　　 二、PKA及PLA2参与了CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道的激活过程。　　 三、CHA通过先激活PKA然后再抑制PLA2活性，进而增加大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜50 pS钾离子通道的活性，即：CHA通过PKA-PLA2信号转导途径增加50 pS钾离子通道的活性。