萝卜硫素（1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷）（SFN）是迄今为止蔬菜中所发现的抗癌效果最好的天然活性物之一，美国、日本等国家从20世纪50年代就开始研究SFN的性质、制备方法、肿瘤抑制机制及生理功能等，由于其具有多种抑瘤机制且具有分子量小、治疗指数好等优点，SFN现已成为重点研究的抗肿瘤药候选药物。我国关于SFN的研究较少，关于其抑瘤活性的研究几无报道。本论文利用MTT法、荧光显微术和流式细胞术等方法研究了SFN对人胶质母细胞瘤细胞A172、非小细胞肺癌细胞株H460、肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞株A549生长的影响。对人胶质瘤细胞A172的实验结果表明，较低浓度的萝卜硫素能够诱导A172发生凋亡和调控细胞周期，并主要以后者为主。而萝卜硫素对H460增殖抑制其所需浓度较高，并且主要是通过诱导凋亡通路来实现。可见，SFN对于不同瘤细胞株其增殖抑制机制不同。此外，SFN对A549和HepG2也有增殖抑制作用，结合本课题组前期MTT试验结果：SFN对瘤细胞株HeLa、HL-60、CNE、PC3及P388细胞等均有显著的体外增殖抑制活性且IC50值较低，说明SFN具有很好的新药开发潜力。　　 硫代葡萄糖苷酶（myrosinase，EC3.2.3.1，简称硫苷酶）又称黑芥子酶，是黑芥子苷（硫代葡萄糖苷的一种）水解生成SFN过程的关键酶。在生命进化历程中，硫苷酶基因往往以多个拷贝的形式存在于物种基因组中并在遗传过程中被各物种保留，最终形成了一个相当复杂的基因家族。在甘蓝型油菜中，该基因的研究已非常广泛，而在同为十字花科植物的西兰花中其研究却少见报道。因此，对西兰花硫苷酶基因进行克隆并对其异源表达进行研究对进一步研究该植物的防卫机理和硫苷活性水解产物的获得具有重要的学术意义和实际应用价值。　　 硫苷酶在十字花科植物中的重要功能对硫苷酶基因结构保守性的要求与硫苷酶编码基因的多基因存在及在进化中被保留的现象说明硫苷酶编码基因序列存在相当保守的序列模体和变异相当活跃的区域。因此，利用现有基因数据库中不同物种的硫苷酶编码序列进行同源性比较，探询硫苷酶编码基因的保守序列，设计扩增两兰花硫苷酶编码基因保守序列的引物，结合利用RACE技术，在西兰花中获得硫苷酶基因的全长序列是可行的。本实验以西兰花幼苗为材料，根据同源序列法PCR扩增硫苷酶特异cDNA片段，进一步用3’RACE和5’RACE分别扩增cDNA3’端序列和5’端序列，经序列拼接获得西兰花硫苷酶全长cDNA序列。利用在线蛋白质分析系统对其编码的氨基酸序列进行结构特征分析，NCBI CDD数据库中进行保守结构域查找，在SWISS-MODEL进行在线蛋白同源模建，MEGA3.1构建NJ系统树。结果得到一全长1830bp硫苷酶cDNA，含有一个1641bp的ORF及31bp的5’端非翻译区和158bp的3’端非翻译区，命名为BoMyr2（GenBank登录号为ELJ004075）。编码氨基酸序列含有20氨基酸长度的信号肽并含有9个天冬酰胺N末端糖基化位点，编码的蛋白分子量（Mw）约为62.2kD，等电点（pI）为8.71；BoMyr2推测氨基酸序列含有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶结构域，其编码蛋白与PDB库中自芥硫苷酶有相似的三维结构，具有明显的β/α（TIM）桶结构；BoMyr2应归为硫苷酶基因家族的MB亚族。　　 由于硫苷酶是一类非组织型表达的蛋白，通常在植物体内含量较低，并且由MB亚族基因编码的硫苷酶在植物体内往往与硫苷酶结合蛋白形成复合物，因此，从植物源出发通过分离纯化获得大量的硫苷酶很难实现。西兰花硫昔酶的原核表达现无资料公开报道。根据RACE结果设计引物扩增硫苷酶成熟蛋白编码区序列，以pGEX-4T-1为载体，在大肠杆菌BL21中进行GST融合蛋白表达。经SDS-PAGE检测，发现在90kD左右处有一明显的蛋白条带。预测的硫苷酶成熟蛋白分子量为60.17kDa，而融合蛋白N端融合标签蛋白分子量约为26kDa，表达产物与与预期大小一致。说明硫苷酶成熟蛋白在BL21中融合表达成功。不同时间点GST融合蛋白表达比较发现，融合蛋白的诱导表达具有累积作用，在诱导4h后，蛋白表达量己较高，到6小时达最大。融合蛋白活性测定发现，表达的融合蛋白基本没有催化底物sinigrin的能力，即融合蛋白缺乏硫苷酶活性，有必要进行进一步的凝血酶酶切加工以及蛋白变性、复性等方面的研究。　　 蛋白数据库（PDB）中三维结构已阐明的硫苷酶均存在糖基化现象，利用不同模型对GenBank中已登录的硫苷酶全长cDNA序列进行信号肽预测发现，其编码基因均含有一段典型信号肽编码序列，说明硫苷酶蛋白在黑芥子酶细胞ER膜上合成后转运到黑芥子酶颗粒的过程中发生了糖基化反应。毕赤酵母（Pichia pastoris）具有对外源蛋白进行适度糖基化修饰的作用。因此，进一步将西兰花BoMyr2成熟蛋白编码序列重组到Pichiapastoris分泌型表达载体pPIC9K上，得到重组酵母表达载体pPIC9K-BoMyr2，经Sac I线性化后电转导入Pichia pastoris KM71。菌落PCR以及重组酵母的SDS-PAGE分析发现，硫苷酶在Pichia pastoris中进行分泌表达，表达蛋白分子量约为65kDa。酶活测定显示，表达较好的6株菌株（13＃、15＃、5＃、21＃、41＃、29＃、36＃），13＃、15＃重组菌株其发酵液上清硫苷酶酶活可达1.7～1.9U/ml，而36＃菌株其活性为O.75U/ml。硫苷酶比活力分析发现，同样是13＃、15＃重组菌株比活力较高，相关分析发现两者相关性达95％，说明发酵上清的蛋白量可基本反映外源蛋白的表达情况和硫苷酶活性。　　 将酶活相对较高的13＃菌株，进一步进行摇瓶发酵研究。结果表明，在BMMY培养基中，pH6.0、1.0％甲醇浓度可以获得较好的表达水平；0.05％的油酸和0.1％的表面活性剂吐温20可以少量提高硫苷酶的表达。诱导培养36小时后发酵上清中硫苷酶总酶活较好，适于发酵液的回收。重组毕赤酵母在合适条件下其发酵上清酶活可达到3U/ml左右。　　 MA基因亚族编码的自由态硫苷酶已得到广泛深入的研究，而关于MB基因亚族编码的硫苷酶因在植物体内的表达情况、存在形式等因素其生化特性至今很少被触及。BoMyr2基因的克隆及其在毕赤酵母基因组中整合、分泌表达不但为大量获得纯硫苷酶提供了一条可行的新途径，而且必将有助于研究该酶的结构、功能，研究该酶与其结合蛋白、相关蛋白等相互作用并形成复合物的过程及各类蛋白对蛋白复合体活性影响等方面均具有重要的意义。