【摘 要】
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目的:观察并评估lnc RNA NEAT1对小鼠创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）后神经功能恢复以及神经元凋亡的影响;探究NEAT1发挥神经保护作用的分子机制。方法:10-12周龄、体重为18-20克的雄性C57BL/6J小鼠90只,按随机数字表分为以下几组:假手术组（n=15）,空白对照组（n=15）,NEAT1上调组（n=15）,NEAT1上调空载病毒组（n=
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目的:观察并评估lnc RNA NEAT1对小鼠创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）后神经功能恢复以及神经元凋亡的影响;探究NEAT1发挥神经保护作用的分子机制。方法:10-12周龄、体重为18-20克的雄性C57BL/6J小鼠90只,按随机数字表分为以下几组:假手术组（n=15）,空白对照组（n=15）,NEAT1上调组（n=15）,NEAT1上调空载病毒组（n=15）,NEAT1下调组（n=15）,NEAT1下调空载病毒组（n=15）。构建过表达NEAT1基因、沉默NEAT1基因的腺病毒,并分别侧脑室转染NEAT1上调组、NEAT1上调空载病毒组、NEAT1下调组与NEAT1下调空载病毒组的小鼠,空白对照组小鼠侧脑室内注射等量生理盐水。转染一周后,在TBI-0310颅脑创伤仪上按照以下参数建立控制性皮层撞击模型（Controlled cortical injury,CCI）来模拟TBI,参数即:装机探头直径3mm,撞击速度5m/s,接触时间100ms,撞击深度1.5mm。实验一:调控NEAT1对小鼠TBI后神经功能恢复的影响在撞击前1天、撞击后第1、3、7、14、21、28天进行神经功能缺失评价（Neurological severity score,NSS）、抓线实验以评估小数的神经功能。TBI后第15-20天进行莫里斯水迷宫实验以评估小鼠的学习能力和空间记忆能力。实验二:调控NEAT1对TBI小鼠伤灶周围细胞凋亡水平的影响TBI后第3天,异氟烷麻醉小鼠,经心脏依次灌注生理盐水50ml、4%多聚甲醛30ml后剥离完整脑组织,4%多聚甲醛浸泡、30%蔗糖溶液依次浸泡。一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Servicebio,China）用于细胞凋亡的检测,以此判断凋亡与行为学的关系。实验三:TBI后Pidd1、caspase2、caspase9、caspase3的表达变化选取撞击后6小时、1、3、7天共四个时间点对空白对照组小鼠进行Western blot检测,观察Pidd1、caspase2、caspase9、caspase3随时间的表达变化趋势,以此敲定后续实验的检测时间节点。实验四:调控NEAT1对TBI小鼠Pidd1、caspase2、线粒体内外Cyt c和caspase3表达的影响TBI后第3天,通过过表达和敲除NEAT1基因,免疫荧光半定量检测Pidd1蛋白的表达;Western blot检测小鼠皮层细胞内凋亡相关蛋白Pidd1、caspase2、线粒体内外Cyt c和caspase3的表达。以此分析NEAT1对凋亡的调控机制。结果:实验一:NSS评分显示NEAT1上调组小鼠得分明显低于空白对照组,而NEAT1下调组小鼠得分则显著升高。抓线实验可见,与空白对照组比较,NEAT1上调组的小鼠分数明显升高,而NEAT1下调组小鼠分数显著降低。莫里斯水迷宫见TBI后第16-19天,NEAT1上调组小鼠找到隐藏平台的时间较空白对照组明显缩短,NEAT1下调组小鼠耗时显著延长;TBI后第20天,NEAT1上调组小鼠反复穿梭徘徊于第三象限,在第三象限内游动轨迹及时间延长,NEAT1下调组小鼠游动轨迹杂乱无章,在第三象限内游动轨迹及时间缩短。实验二:TUNEL结果显示,与空白对照组相比,NEAT1上调组凋亡细胞数量明显减少,NEAT1下调组的凋亡细胞数增多。实验三:Western blot显示,Pidd1与caspase2在撞击后1天表达开始显著升高,而caspase9与caspase3在撞击后3天表达量开始明显升高。实验四:免疫荧光及Western blot均显示,TBI后第3天,与空白对照组和空载病毒组相比,NEAT1上调组小鼠Pidd1、caspase2、胞浆内Cyt c以及caspase3的表达显著降低,线粒体内Cyt c表达升高;而下调NEAT1基因后,Pidd1、caspase2、胞浆内Cyt c以及caspase3的表达显著升高,线粒体内Cyt c表达降低。结论:调控NEAT1基因可通过影响神经元凋亡进而改变脑外伤的预后。其机制可能为:NEAT1与Pidd1发生结合,随后抑制capsase2活化,进而抑制线粒体凋亡通路的激活,减少神经元凋亡,改善了TBI的预后。
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