唇腭裂是颅颌面部一种常见的先天畸形,其发病率因地理位置、社会经济发展程度和种族的不同,具有一定差异性,其发生率大约为1/500-1/1000。其中黄种人主要是亚洲人发病率最高,白种人其次,黑种人最低。流行病学调查表明,我国的发生率为0.182%,是我国主要的出生缺陷之一。通常根据是否存在其他系统或器官的先天畸形,将唇腭裂分为:非综合征型唇腭裂和综合征型唇腭裂。非综合征型唇腭裂(Nonsyndromic orofacial clefts,NSOC)是指不伴发其他系统畸形的不属任何综合征的唇裂、唇裂合并腭裂的总称,是一种不符合孟德尔遗传模式的多基因遗传病。非综合征型唇腭裂的发病原因复杂,呈现一种多因素多阶段的特性。目前认为唇腭裂是一种由环境危险因素与遗传因素的共同作用所致,且具有显著的遗传异质性。利用基因连锁研究、候选基因相关联以及全基因组扫描等方法已鉴定出多个与NSOC有关的易感基因和突变位点,其中包括基因IRF6,MTHFR,MSX1,BMP4以及FGF基因家族和WNT基因家族成员。随着遗传学及流行病学的迅猛发展,不断有新的易感基因被发现。但是由于NSOC病因的复杂性、遗传模式的不确定性、不同地区甚至不同表型NSOC的候选基因座差异性,使研究结果重复性差,出现较多分歧,有的甚至出现背离,这仍是一个亟待解决的问题。以往的研究结果表明,我国唇腭裂患者的发病因素及机制可能与西方国家患者不同。迄今为止,在中国汉族人群中,有关NSOC的发病与FGF5和AXIN2多态性的相关性还不清楚。为了充分认识AXIN2和FGF5基因在中国汉族人群NSOC的发病中的作用和地位,不断完善和发展这两种基因在唇腭裂发病机制的研究,以及为将来唇腭裂的产前诊断和预防提供科学依据,因此本研究尝试探索在中国汉族人群中AXIN2和FGF5基因SNPs与NSOC相关性。为临床基因诊断提供理论依据,以对有NSOC病人的家庭提供有效遗传咨询,最终达到降低唇腭裂发生率的目的。轴蛋白抑制因子(axis inhibition protein 2,AXIN2)作为构架蛋白,是WNT信号转导通路中的负性调节因子。而WNT信号通路是参与胚胎发育过程中非常重要成员之一,可以调节细胞的增殖、分化以及凋亡相关的生物学过程。在WNT信号转导通路中,AXIN2可以与β-连环蛋白、酪蛋白激酶-I、肠腺瘤性息肉病蛋白和GSK-3β组合起来形成β-连环蛋白降解复合体,激活β-连环蛋白的磷酸化并使其降解,而β-连环蛋白是WNT信号通路中非常重要的成员之一,因此AXIN2使β-连环蛋白在细胞质内保持较低水平,从而负调节WNT信号通路。在胚胎发育过程中AXIN2存在于多种组织中,并呈现阶段性特异性表达。有胚胎发育学发现,AXIN2在小鼠胚胎体轴、背侧神经管嵴,发育中的体节、鳃弓和肢芽里均有表达。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)为FGF基因家族编码的结构相关蛋白与其受体(fibroblast growthfactor receptors.FGFRs)的结合,广泛分布于全身。FGF基因家族由24个成员组成,它们不仅促进胚胎组织的发育和分化,而且参与组织再生、创伤的愈合以及调节内分泌作用等病理生理过程。FGF5是FGF基因家族内的重要成员。研究发现FGF5是影响动物毛发长度的重要影响因子,参与调控毛囊从兴盛期向休眠期转化,对毛发生长具有抑制作用。另外,胚胎发育学研究表明FGF5参与早期胚胎发育,在胚胎发育整个过程中某些重要的生长中心,例如神经管以及生皮节中均有特异性的高表达,另外也有研究表明FGF5突变可能导致某些肿瘤的发生。该研究采用病例对照研究方法,收集599例中国汉族NSOC患者及602例健康对照外周血标本病例,主要于2008年8月至2012年2月在江苏省口腔医院、南京市儿童医院、徐州市儿童医院、淮安市第一人民医院等地收集而得。通过数据库筛查挑选出4个AXIN2多态性位点(rs2240307,rs11867417,rs2240308和rs7591);3个位于FGF5基因3’UTR区域多态性位点(rs3733336,rs4690150和rs6838203)。基因分型方法采用SNPscanrM高通量SNP分型技术。该技术采用连接酶连接反应的高特异性实现对SNP位点等位基因的识别,利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增,通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离,最后通过对GeneMapper软件分析获取各个SNP位点的基因型。分型结果发现所挑选的4个AXIN2多态性位点(rs2240307,rs11867417,rs2240308和rs7591)与NSOC无明显相关性。在对NSOC亚型的进一步分层分析显示,多态性位点rs2240307在NSOC病例组与健康对照组之间基因型AA、AG和GG分布上存在差异(P = 0.048),并且GG基因型可能增加罹患单纯性腭裂风险(OR = 3.22,95%CI = 1.13-9.18),而A等位基因可以降低罹患单纯性腭裂的风险(OR=0.30,95%CI=0.11-0.84)。连锁不平衡分析显示AXIN2两个多态性位点rs11867417和rs7591存在关联,但是在单倍型分型中这两个位点未显示出与NSOC易感性存在相关性。而所筛选出的2个FGF5多态性位点中rs4690150和rs6838203与中国汉族人群NSOC易感性无明显相关,而rs3733336多态性位点NSOC病例组与对照组之间基因型分布存在统计学差异(P=0.004)。GA基因型、GG基因型较AA基因型罹患NSOC风险降低0.26倍和0.52倍。而总突变型(GA/GG)可降低风险30%。进一步分层分析显示,GA基因型可降低罹患CL/P和CPO的风险,GG基因型可降低CL/P和CLO的风险,GA/GG基因型可以降低所有NSOC亚型即CL/P、CLP、CLO和CPO的风险。另外两个多态性位点rs4690150及rs6838203则未发现与NSOC亚型易感性相关联。由于前阶段研究发现FGF5基因3’UTR区域多态性位点rs3733336与中国汉族人群非综合征型唇腭裂易感性相关联。我们利用生物信息学网站预测到rs3733336位于miR-145与FGF5的3’UTR的结合区域下游约30bp,推测rs3733336可能通过改变miRNA结合能力对NSOC易感性产生影响。将miR-145mimics 转染至 cos7、C2C12 和 293A 细胞,通过 RT-PCR 观察 miR-145对于细胞内源性FGF5mRNA及蛋白的表达情况发现,miR-145可以降低FGF5mRNA及蛋白的表达(P<0.05),证明miR-145与FGF5存在靶向结合关系。为了进一步验证rs3733336是否影响miRNA的结合,我们进行了双荧光素酶报告基因实验,构建了FGF5 3’UTR报告基因(含A或G等位基因)分别与miR-145 mimics共转染至cos7、C2C12和293A三株细胞系,结果表明,rs3733336 A和G等位基因均可以影响miR-145与FGF5基因3’UTR的结合能力,但是G等位基因较A等位基因的对于FGF5基因3’UTR表达的降低作用更为明显(P值均小于0.05)。另外在对55例中国汉族NSOC患者组织标本FGF5 mRNA表达情况时发现,尽管三种基因型AA、GA和GG之间不存在统计学差异,但是其趋势是GG基因型患者FGF5 mRNA表达水平最低,GA基因型其次,AA基因型最高。综上所述,本病例对照研究研究结果提示AXIN2多态性位点rs2240307可能增加中国汉族人群罹患单纯性腭裂的风险,而位于FGF5基因3’UTR区域多态性位点rs3733336与该人群NSOC及其亚型易感性有相关性,该位点可以影响miR-145与FGF5的结合能力,从而影响FGF5的表达。以上结果有助于对中国汉族人群NSOC病因学的进一步探究。