嗜热链球菌是酸乳、干酪等发酵乳制品的主要发酵剂。嗜热链球菌产生的游离胞外多糖（free exopolysaccharide,f-EPS）是天然的质地改良剂,并且具有抗氧化、免疫调节和抗癌等益生特性,因而成为研究者最感兴趣的发酵产物之一。分析f-EPS生物合成调控机制,使嗜热链球菌能够可控且稳定的产生f-EPS是研究者所关注的重点。本研究以高产f-EPS的嗜热链球菌937为研究对象,在限定化学成分培养基中探究各营养成分对f-EPS生物合成的影响及其作用机制。取得主要实验结果如下:1.有效分离嗜热链球菌所产的f-EPS并进行准确定量是进行f-EPS生物合成调控研究的基础,培养基种类及分离方法将直接影响f-EPS的分离定量。本研究选取了 3种常用的嗜热链球菌培养基（M17培养基、完整限定化学成分培养基CDM（C）和复原脱脂乳培养基（RSM））和3种f-EPS分离方法,通过测定背景信号、黄原胶回收率及发酵后样品的f-EPS产量,评估了培养基和分离方法对f-EPS定量的影响。结果显示,M17培养基的背景信号高达234μg/mL,黄原胶回收率超过200%。RSM的背景信号低于10 μg/mL,黄原胶最大回收率为64%。CDM（C）的背景信号低于2 μg/mL,黄原胶回收率平均为90%。在CDM（C）和RSM中,不同f-EPS产量的嗜热链球菌得到良好区分,但RSM中f-EPS的定量结果受到分离方法的强烈影响。研究结果表明,使用CDM（C）培养基能够对菌株所产f-EPS进行准确定量,且定量结果不受培养基成分和分离方法的影响,可用于开展后续f-EPS生物合成调控研究。2.明确影响嗜热链球菌生长和f-EPS生物合成的营养成分,可为探索f-EPS生物合成的调控方式提供研究方向。本研究以高产f-EPS的嗜热链球菌937为研究对象,通过单因素控制法,评估了 CDM（C）中碳水化合物、氨基酸、B族维生素和核酸碱基成分对菌株生长和f-EPS产量的影响。结果显示,嗜热链球菌937更适合在以乳糖、蔗糖或葡萄糖为碳源的CDM（C）中生长;色氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及酪氨酸是菌株生长的必需氨基酸;泛酸钙、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醇及盐酸硫胺素是菌株生长的必需B族维生素。嗜热链球菌f-EPS产量受乳糖、组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、泛酸钙、核黄素、烟酸等营养成分浓度的显著影响（p＜0.05）。进一步研究发现,当同时将乳糖浓度提升至2%,组氨酸、异亮氨酸和谷氨酸浓度菌提升至15 mM时,菌株生长不受影响但f-EPS产量较CDM（C）中提升近3倍。研究结果表明,乳糖、组氨酸、异亮氨酸和谷氨酸浓度的提升能够显著提升嗜热链球菌937的f-EPS产量（p＜0.05）,且3种氨基酸和乳糖对f-EPS产量的促进作用并不互斥。3.为进一步研究组氨酸、异亮氨酸和谷氨酸增强嗜热链球菌937 f-EPS生物合成的作用方式,对嗜热链球菌937进行全基因组测序,从糖转运、核苷酸糖合成及eps基因簇等方面分析f-EPS合成途径;并测定菌株在3种氨基酸浓度为1 mM（CDM（O））或15 mM（CDM+HIG）的培养基中的生长动力学、f-EPS生物合成途径中关键基因的表达水平、参与核苷酸糖合成的酶活性以及乳糖代谢情况。结果显示,嗜热链球菌937存在转运葡萄糖、蔗糖等特异性PTS转运系统和乳糖渗透酶;菌株具有合成UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖和dTDP-鼠李糖的潜力;菌株染色体上存在由18个编码基因组成的eps基因簇。与CDM（O）培养基相比,嗜热链球菌937在CDM+HIG中的f-EPS产量和活菌数量提升了 2倍;galK、galT、galU、galE、epsA、epsB和epsC转录水平显著上调（p＜0.05）;GalE、GalU和GalT的酶活性显著增加（p＜0.05）;菌株乳糖消耗量显著增加（p＜0.05）,乳酸和半乳糖分泌量与CDM（O）中无显著差异（p＞0.05）,且胞内pH显著高于CDM（O）中。研究结果表明,3种氨基酸浓度提升后,可能通过维持活细胞数量、促进半乳糖代谢、促进核苷酸糖合成和上调eps基因簇的转录水平来提高f-EPS的产量。4.为探究组氨酸、异亮氨酸和谷氨酸通过维持活菌数量、促进核苷酸糖合成及上调epsABCD转录水平等方式增强嗜热链球菌937 f-EPS生物合成的具体作用机制,对嗜热链球菌937在CDM（O）及CDM+HIG培养至5 h的培养物进行了转录组学测定,并通过qPCR测定了单个氨基酸浓度提升对部分显著差异基因转录水平的影响。结果显示,与CDM（O）相比,嗜热链球菌937在CDM+HIG中共有249个基因发生了显著变化。在差异基因显著富集的KEGG通路中:组氨酸合成通路、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸合成通路和嘌呤代谢通路上基因的显著上调能够促进5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）的消耗,使得更多Glc 6-P经磷酸戊糖途径生成PRPP;缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢通路上基因的显著上调能够促进丙酮酸消耗。PRPP和丙酮酸的消耗,将直接导致乳酸产量的降低。进一步的qPCR结果显示,嗜热链球菌937在CDM+HIG中的半乳糖代谢和核苷酸糖合成相关基因的显著上调归因于谷氨酸浓度的提升,并且谷氨酸对半乳糖代谢转录调控因子lacI的具有诱导表达作用;epsABD转录水平的上调是由组氨酸和异亮氨酸浓度提升所导致,epsA CD转录水平的上调是由异亮氨酸浓度提升所导致;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成相关基因转录水平上调是由异亮氨酸和谷氨酸浓度提升所导致;组氨酸合成,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成相关基因转录水平上调是由异亮氨酸提升所导致。研究结果表明,3种氨基酸对增强嗜热链球菌937 f-EPS生物合成具有不同的作用机制:异亮氨酸浓度提升后,通过促进PRPP和丙酮酸的消耗,维持了菌株活菌数量;谷氨酸浓度提升后,促进了半乳糖代谢和核苷酸糖合成;组氨酸浓度提升后,上调了 epsABD的转录水平。本研究通过在限定化学成分培养基中探究营养成分对嗜热链球菌937生长及f-EPS合成的影响,发现了能够增强嗜热链球菌937f-EPS生物合成的新因素（组氨酸、异亮氨酸和谷氨酸）,并阐明了其潜在作用机制,为调控f-EPS生物合成提供了理论基础和新思路。