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长春花(Catharnthus roseus)属于夹竹桃科,是一种在热带地区发现的多年生植物,又被称为vinca roseus或者Madagascar periwinkle。长春花也是黄龙病菌亚洲种(CLas)的宿主。CLas在长春花上表现出不同的症状。与柑橘相比,柑橘黄龙病在长春花上能在较短的时间内表现出典型症状。因此长春花是研究CLas致病机理和病原寄主互作的理想试验材料。在本研究中,我们以下胚轴、叶片和枝条为外植体,优化了植物生长激素对长春花愈伤组织诱导和再生的影响。同时,首次将红色荧光蛋白(Ds Red2)作为长春花遗传转化的分子标记,成功建立了长春花遗传转化技术。主要研究成果如下:本研究对不同浓度的6-苄基氨基嘌呤(BAP)、萘乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚丁酸(IBA)对长春花遗传再生的影响进行了优化,结果表明,长春花下胚轴在M6培养基:MS+BAP(2.0 mg/L)+NAA(1.0 mg/L)+2,4-D(1.0 mg/L)上,愈伤组织诱导率最高为98.8%。叶片外植体在M5培养基:MS+BAP(2.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)+2,4-D(0.5 mg/L)上愈伤组织诱导率最高为94.0%。此外,直接芽再生试验表明:在MS1培养基:MS+6BA(1.0 mg/L)+NAA(0.4 mg/L)上,平均每个单芽产生7.0±2.0个新梢,芽诱导率最高为97.0%。而在通过诱导愈伤组织间接芽再生的器官发生途径中,在MS1[MS+BAP(1.0 mg/L)+NAA(0.4 mg/L)]和MS5[MS+BAP(2.0 mg/L)+NAA(0.3 mg/L)]培养基中,芽诱导率最高均为94.0%。在MS1培养基:MS+BAP(1.0 mg/L)+NAA(0.4 mg/L)内芽增值率最高,平均为18.7±3.51。在MS5培养基:[MS+BAP(2.0 mg/L)+NAA(0.3 mg/L)]芽增值率最低,平均为15.7±5.13。在[1/2MS+IBA 2.5 mg/L+NAA(0.5 mg/L)+蔗糖(30 g/L)+琼脂(5.5 g/L)]培养基中的生根率最高为88.0%。此外,利用农杆菌EHA105和pCAMBIA2300::35S::DsRed2介导的二元载体包含增强的35S启动子,长春花变种Pacific white(PW),Pacific Grapevine Red(PGR)和Pacific cherry Red(PCR)的遗传转化技术)已优化。最佳转化条件是:以长春花下胚轴为外植体,根癌农杆菌侵染25分钟,19°C条件下在1/2MS+AS(100μM)培养基上共培养2天,效果最佳。通过对不同浓度的卡那霉素(40,50,70 mg/L)对再生效率的影响的优化,长春花PGR、PCR和PW的遗传再生率分别为55.5%、45.5%和38.0%。通过对Ds Red2蛋白表达的肉眼观察和荧光显微镜下镜检观察,Ds Red2不仅在愈伤组织中可以检测到,而且在叶、茎等器官中都有很强的信号。进一步结合PCR方法对转基因系中的Ds Red2的表达进行验证,在获得的30个不同品种的转基因系中,阳性植株为21株,PGR、PCR和PW的阳性转化率分别为77.7%、75.0%和55.5%。运用含有Ca MV-35S启动子的双元载体Ds Red2,对两个柑橘品种甜橙(Citrus sinensis)和沙田柚(Citrus maxima)进行了遗传转化研究。分别以柑橘上胚轴为外植体,通过对遗传转化参数的的优化,获得最佳遗传转化方法为:根癌农杆菌最适浓度OD600=0.6,最佳侵染时间为25 min,在19°C条件下,在MT+麦芽提取物(0.5 g/L)+L-谷氨酰胺(1.5 g/L)培养基中共培养72 h,转化效率最高。甜橙最高转化率为50.0%,沙田柚的最高转化效率为35.5%。利用荧光显微镜观察到Ds Red2蛋白在甜橙和沙田柚的叶、茎等部位都产生较强的红色信号。总之,本试验首次成功的将Ds Red2荧光蛋白作为标记,运用于长春花和柑橘遗传转化,成功获得了转基因阳性植株,为下一步开展利用基因编辑技术进行抗黄龙病病育种工作奠定了基础。