听神经病(auditory neuropathy,AN)是一种特殊的听觉功能障碍性疾病,以言语理解能力受损为主要表现,其临床特征及诊断的相关认识已不断加深,但病变部位及病理机制仍是国内外研究的热点与难点,治疗和干预存在极大困难。随着分子诊断技术的不断发展,已认识到部分AN与遗传相关,目前已发现多种AN相关基因,AIFM1(apoptosis-inducing factor,mitochondria-associated,1)基因为其中之一,本课题组首先发现其与AN相关,早期认为遗传模式为X-连锁隐性遗传,且临床中越来越多迟发性AN患者检出AIFM1基因突变,对这些患者进行基因型表型的相关性分析及随访分析具有重要意义;另外,目前尚无Aimf1听神经病相关点突变动物模型,进行特定动物模型构建的初步探究将为进一步进行致病机制的研究提供基础,也为其他点突变动物模型的构建提供参考。本研究分两部分:第一部分为AIFM1基因突变相关听神经病患者基因型与表型分析;第二部分为Aifm1基因AN相关特定突变小鼠模型构建的初步探究。第一部分:AIFM1基因突变相关听神经病患者基因型与表型分析目的 分析AIFM1基因突变相关AN患者基因型与表型关系,同时进行随访,以期从临床表现、遗传学及自然病程变化深入了解AIFM1基因突变阳性AN患者特征,为临床诊断及定位分型提供参考。方法 1.对来自36个家庭的50例(包括本课题组前期已报道的16个家庭的30例患者)AIFM1基因突变阳性AN患者进行基因型与表型的分析,主要包括基本特征、首诊时纯音测听、言语识别率、各项听觉诱发电位测试等听力学检查结果;2.绘制基因突变图谱,总结突变位点及所在结构域;3.按随访时间小于10年、大于10年对随访患者的纯音测听变化进行分析;4.对比同一突变的男性女性听力差异,分析1个特殊家系遗传特征及听力表型。结果 1.50例AIFM1基因突变相关听神经病患者中,男性45例,女性5例;所纳入患者均表现为迟发性听力损失,就诊年龄为23.2±8.4岁,发病年龄为13.4±3.9岁;多为低频听力下降(78.8%),程度表现各异,以中度和中重度为主(67%);均无新生儿高危因素;伴随症状包括耳鸣、四肢麻木、头晕眩晕、步态不稳等,耳鸣最为多见,占74%;15例(30耳)患者行VEMP测试,19耳(63.3%)波形异常;27例患者(51耳)首诊行耳蜗电图测试,3耳未引出反应波,48耳引出反应波(94.1%),且均可见-SP,40耳(78.4%)引出AP,-SP/AP值均大于0.4;14例患者进行了内听道磁共振检查,其中7例表现为双侧蜗神经发育不全。2.本次新增20例患者中,共鉴定AIFM1基因7个新的突变位点和3个已报道位点;7 个新的位点均为错义突变,分别为 c.547A>T(p.Thr183Ser)、c.881G>A(p.Arg294Gln)、c.890A>T(p.Lys297Ile)、c.912C>G(p.Ile304Met)、c.997C>T(p.Leu333Phe)、c.1394C>T(p.Ala465Val)及c.1678T>C(p.Tyr560His);50名患者中共检出18个突变位点,主要位于NADH结构域(6个)和FAD结构域(9个);36个家庭中,检出p.Leu344Phe比例最大,为36.1%。3.对16例男性患者的随访纯音测听结果分析发现,随访时间为10年以下的患者,听力无明显变化;但随访时间大于10年时,患者的低频(250、500Hz)和高频(4000、8000Hz)听阈出现显著提高(p<0.01)。4.纳入研究对象中,5名女性患者突变均为p.Leu344Phe,其中1个家系遗传模式初步判断符合X-连锁显性遗传;该突变位点的男性女性之间听力无明显差异。结论AIFM1基因是中国迟发性AN患者的主要相关基因,最常见的变异为p.Leu344Phe;AIFM1基因突变阳性听力损失可随疾病进展加重;另外,AIFM1基因突变相关的AN可能存在X-连锁显性遗传模式。第二部分:Aifm1基因AN相关特定突变小鼠模型构建的初步探究目的 构建Aifm1基因AN相关特定突变小鼠模型,并对所得模型进行初步评估,确定所得动物模型是否可进一步用于病理机制等探究。方法 1.根据临床病例情况及蛋白结构预测选择特定位点p.Thr260Ala(在小鼠对应p.Thr259Ala)进行动物模型的构建,设计gRNA,构建突变打靶载体,采用显微注射技术将改建后基因片段注入小鼠受精卵,移植代孕母鼠,最终得到p.Thr259Ala突变小鼠,该步骤与北京生命科学研究所共同完成;2.进行引物设计,对得到的小鼠进行基因型鉴定并繁殖;3.选择孕期14天左右的小鼠,获取小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),进行基因型鉴定,对不同基因型的MEF细胞进行培养,通过实时荧光定量PCR(qPCR),对比转录水平差异,并进行Western Blot及免疫荧光染色,对比翻译水平差异;4.分别对野生型小鼠及纯合突变小鼠进行耳蜗组织qPCR及Western Blot;初步对2月龄阳性小鼠15只,野生型小鼠17只进行Click ABR及TB-ABR测试,观察波形并测试阈值,对比组间是否存在差异。结果 1.得到Aifm1 p.Thr259Ala转基因小鼠并进行鉴定繁殖,得到不同基因型小鼠;2.阳性MEF细胞与野生型相比,Aifm1转录水平未见明显差异,蛋白表达水平低于野生型,耳蜗观察结果与其一致;3.2月龄阳性小鼠与野生型小鼠各频率听力均无明显差异(p>0.05);结论 已得到Aifm1特定点突变(p.Thr259Ala)的不同基因型小鼠,但目前暂不能确定所得转基因小鼠是否符合临床患者迟发性AN表型,需进一步评估。