研究背景促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种由肾脏分泌的,含有唾液酸的糖蛋白,以往认为它的主要生物学作用是能够与EPO受体(EPOreceptor, EPOR)结合后促进红系祖细胞分化为成熟的红细胞从而增加循环中的红细胞的数量,因此,EPO被广泛应用于治疗多种原因引起的贫血,如肾性贫血、新生儿贫血、癌性贫血等。近年来研究发现,EPO及其受体还广泛分布于各种非造血组织,例如心脏、神经系统等,能够通过抑制细胞凋亡,减少炎性因子分泌及炎症细胞浸润,促进新生血管生长等机制而发挥多种非造血作用,如神经、心脏等组织保护作用,所以被认为是一种全身性的保护性细胞因子。但是促红素本身具有促进红细胞增生的作用,可能会导致血液粘稠度增加,血流动力学发生改变而诱发血栓形成,因而限制了EPO的对于脑梗死等疾病的临床应用。然而,促红细胞生成素的衍生物,氨甲酰基促红细胞生成素(carbamylated EPO, CEPO)与促红细胞生成素不同,CEPO既保留了EPO的神经组织保护作用,又不刺激造血系统,没有促进红细胞增生的作用。有学者发现在肾脏病变晚期的患者体内尿素及其衍生物氰酸盐等浓度增高后,可使EPO发生氨甲酰化反应生成CEPO,使EPO的造血活性降低并最终加重病人贫血。随后又有学者在体外用氰酸钾与重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rhEPO)共同孵育后使rhEPO中的赖氨酸氨甲酰化,得到CEPO,并通过动物实验证实,CEPO与EPO不同,不会影响动物的红细胞比容,但对于脑梗死等动物模型仍具有抑制细胞凋亡及改善动物预后等神经组织保护作用,且应用于脊髓损伤、蛛网膜下腔出血、周围神经损伤、实验性自身免疫性脑脊髓炎等动物模型后发现CEPO均具有相似的神经保护作用,CEPO既保留了EPO的神经保护作用,又去除了其促进红细胞增生而诱发血栓形成等副作用。过氧化氢是机体代谢的产物,同时它也是一种活性氧,易透过细胞膜,与细胞内的金属离子反应形成高活性的氧自由基,导致一系列反应,最终引起细胞的损伤甚至死亡,现已成为研究缺氧等所致的细胞氧自由基损伤的重要工具。采用体外培养的神经细胞氧自由基损伤模型,可排除整体情况下缺氧伴发的酸中毒、高碳酸血症等诸多因素的影响。SH-SY5Y细胞来源于人神经母细胞瘤细胞,是一种分化程度较低的肿瘤细胞,该细胞具有明显的轴突,其形态、生理和生化功能等与正常神经细胞相似,同时最近十几年逐渐被越来越多地应用于神经病学实验研究中。研究目的观察CEPO对过氧化氢损害的神经母细胞瘤细胞的保护作用,并与相同剂量的EPO进行比较,观察CEPO对神经细胞的保护作用与EPO有无差异,并对其可能机制进行探讨。研究方法一、氨甲酰基促红素的制备与鉴定1、氨甲酰基促红素的制备先将EPO干粉50000 IU(0.5mg)与适量的硼酸钠和氰酸钾混匀,温育23小时后透析。用考马斯亮蓝G250法测定获得的CEPO蛋白浓度。取100IU上述制得的CEPO,经二硫赤藓糖醇与碘化乙酰胺作用后,加至经0.05mmol/L碳酸氢胺和0.4 mol/L尿素溶液平衡的Hi Trap G25柱,进样后收集首柱1/3-1/2体积的洗脱液。用考马斯亮蓝G250法测定收集液体中的蛋白浓度。促红素和上柱后的流出液各取100IU,分别加入0.4μg Lys-c蛋白内切酶(endoproteinase Lys-C),37℃孵育20小时,得其经酶作用后的产物。2、氨甲酰基促红素的鉴定经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),加样依次为：①Marker蛋白；②未经酶切的EPO 50IU；③EPO经Lys-c蛋白内切酶酶解后的产物15μL；④EPO氨甲酰化后经Lys-c蛋白内切酶酶解后的产物15μL；⑤EPO氨甲酰化后所得产物50IU。电泳结束后取出分离胶,用银染方法对蛋白进行染色。二、CEPO对过氧化氢损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用的观察及研究1、过氧化氢损伤模型的建立调节SH-SY5Y细胞密度后接种于6孔板,12小时后分别加入不同浓度的过氧化氢(0、50、200、300、400μmol/L),12小时后收集细胞,用噻唑兰(methylthiazoletetrazolium, MTT)法测细胞存活率,根据MTT值判定实验所需采用的过氧化氢浓度。2、实验分组根据选用的不同的过氧化氢浓度,将细胞分为2大组进行实验,第1大组采用过氧化氢浓度为300μmol/L,又分为以下几个小组：①对照组,即过氧化氢组；②CEPO组；③EPO组；以上各组加入含300μmol/L过氧化氢培养液培养12小时后,更换为含相应试剂的培养液培养24小时后进行下一步试验。第2大组为采用400μmol/L过氧化氢,余分组同第1大组。3、细胞形态的观察待培养结束后在相差倒置显微镜下观察各不同分组细胞的形态,尤其是SH-SY5Y细胞的突起,胞体形态等。4、MTT法测定细胞活性将各组SH-SY5Y细胞结束培养后,先后加入MTT及二甲基亚砜作用后,再于自动免疫酶标仪测波长为570nm处的吸光度。该结果可反应细胞的存活率。5、乳酸脱氢酶的测定以损伤的SH-SY5Y细胞LDH的释放量作为定量评价细胞损伤的指标。乳酸脱氢酶释放量的测定方法依照乳酸脱氢酶测量试剂盒的说明书操作。细胞损伤时乳酸脱氢酶会释放入培养液中,故其上清液中乳酸脱氢酶的多少可反映出细胞的损伤程度。6、AnnexinⅤ/PI双染色检测SH-SY5Y细胞的凋亡各组细胞按不同的方法进行培养,待结束培养后,加入凋亡试剂处理,再用PBS溶液将其洗涤并处理成单个细胞,在流式细胞仪上检测细胞的凋亡率。7、荧光定量RT-PCR检测Bcl-2及细胞半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-8的表达各组细胞结束培养后,用Trizol试剂提取细胞总RNA, RT-PCR按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书进行操作。研究结果一、氨甲酰基促红素的制备与鉴定经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果显示,经Lys-C蛋白内切酶酶切后的EPO发生了明显降解,相对分子质量约为3.4×104的EPO谱带完全消失,取而代之的是相对分子质量大约为1.4×10“的蛋白谱带,但EPO经过氰酸钾作用后并上柱的流出液,不论是经Lys-C蛋白内切酶酶切的,还是未经酶切的,均仅为相对分子质量约为3.4×104的单一条带。特别是经蛋白内切酶酶切的EPO氨甲酰化后的产物中未见到降解肽段,即未见到其它相对分子质量小的区域有条带,说明EPO的氨甲酰基化反应十分完全,几乎所有的EPO均转化为CEPO。二、CEPO对过氧化氢损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用的观察及研究1、过氧化氢对SH-SY5Y的MTTT结果的影响结果显示,随着过氧化氢浓度的增加,MTT的值呈下降趋势。根据该结果,我们分别选用浓度为300mol/L、400μmol/L,的过氧化氢进行下一步实验。2、CEPO对细胞形态的影响SH-SY5Y细胞正常培养,不加任何处理时,细胞形态为多边形,胞体较大,胞核饱满,大部分细胞有突起,加用过氧化氢作用后,细胞形态变得不规整,胞核萎缩,细胞突起基本消失；加用不同浓度的CEPO作用后,细胞形态较单独过氧化氢作用时规整,部分细胞可见到神经突起恢复,且随着CEPO的单位浓度的增加,可见到细胞突起的数量增加,胞体形态变得规整。且与EPO组相比,CEPO对细胞形态的影响与相同剂量的EPO是无明显差别的。3、CEPO对细胞存活率的作用结果可见,对照组细胞存活率较低,而与对照组比较,CEPO、EPO组的细胞存活率明显上升,P值小于0.01；且随着CEPO、EPO浓度的增加,细胞存活率呈上升趋势,但当CEPO、EPO浓度由80IU/mL上升至100IU/mL时,细胞存活率的上升趋势变得不明显；相同浓度的CEPO组与EPO组相比,差异无显著性,提示二者对细胞存活率的影响无明显差异。4、CEPO对细胞乳酸脱氢酶的影响细胞损伤时乳酸脱氢酶会释放入培养液中,故其上清液中乳酸脱氢酶的多少可反映出细胞的损伤程度。结果显示,过氧化氢可造成SH-SY5Y细胞损伤,使乳酸脱氢酶的值升高,而CEPO与EPO则能明显减低乳酸脱氢酶的溢出,各组与对照组相比,P值均小于0.01；相同浓度的CEPO组.与EPO组相比,差异无显著性,P值均大于0.01,提示CEPO对乳酸脱氢酶的溢出率的影响与EPO基本相同。5、CEPO对细胞凋亡率的影响结果显示,过氧化氢可造成SH-SY5Y细胞凋亡,CEPO与EPO则能明显减低细胞的凋亡率；且随着CEPO、EPO浓度的增加,细胞凋亡率呈下降趋势,各组与对照组相比,P值均小于0.01；但当CEPO、EPO浓度达到100IU/mL时,细胞凋亡的下降趋势变得不明显,提示CEPO及EPO对细胞凋亡的抑制作用已达顶峰；相同浓度的CEPO组与EPO组相比,差异无显著性,说明CEPO对细胞凋亡率的抑制与EPO的的基本相同。6、CEPO对细胞Bcl-2及Caspase-8的mRNA表达的影响结果显示,与对照组相比,EPO与CEPO组的Bcl-2 mRNA的表达是增高的,而Caspase-8 mRNA的表达是降低的,各组与对照组相比,P值均小于0.01；且随着CEPO、EPO浓度的增加,这种变化趋势更加明显,但当CEPO、EPO浓度由80IU/mL达到100IU/mL时,这种变化趋势变得不明显,说明CEPO及EPO对Bcl-2及Caspase-8的mRNA表达的影响已达到顶峰；相同浓度的CEPO组与EPO组相比,差异无显著性。结论1、利用EPO与氰酸钾共同孵育的方法制备出氨甲酰基促红素并利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定,结果表明,EPO经Lys-C蛋白内切酶酶切后全部降解,而EPO经氨甲酰化后则没有发现经酶切后降解的产物,表明CEPO不仅制备成功,且所获得的CEPO具有极高的纯度。2、经过氧化氢作用后,SH-SY5Y细胞损伤明显,当经不同浓度的CEPO和EPO作用后,细胞的存活率随着CEPO及EPO浓度的增加而上升,乳酸脱氢酶的值随着CEPO及EPO浓度的增加而下降,证明CEPO及EPO对氧自由基损伤的SH-SY5Y细胞具有明显的保护作用,这种对细胞的保护作用是随着浓度的增加而增强的。同时,对于本实验中所采用的不同浓度的过氧化氢,CEPO及EPO均起到了一定程度的保护作用,提示即使对于氧自由基损伤程度较重的SH-SY5Y细胞,CEPO仍具有明显的保护作用,且CEPO对SH-SY5Y细胞的保护作用与EPO是基本相同的。3、经流式细胞仪对Annexin V/PI进行检测,实验结果表明,经过CEPO及EPO的作用后,细胞的凋亡率降低,且随着CEPO及EPO浓度的增加凋亡率降低得更加明显,提示对凋亡的抑制参与了该保护作用。400μmol/L浓度的过氧化氢组的凋亡率下降的程度与300μmol/L浓度组基本相同,提示即使是对于氧自由基损伤程度较重的神经母细胞瘤细胞,不同浓度的CEPO也发挥了其较好的抗凋亡作用。CEPO组与EPO组相比,无明显的差异,提示CEPO与EPO的抗凋亡作用是基本相同的。4、采用荧光定量RT-PCR技术对Bcl-2及caspase-8进行检测,实验结果表明,经过CEPO及EPO的作用后,caspase-8均较对照组降低,而Bcl-2则升高,随着CEPO及EPO浓度的增加而变化得更加明显,但在浓度从80IU/mL上升至100IU/mL时,变化程度则变得不明显,提示CEPO的抗凋亡作用可通过Bcl-2基因的调控及对caspase-8进行抑制作用而实现。400μmol/L浓度的过氧化氢组的凋亡率下降的程度与300μmol/L浓度基本相同,提示即使是对于损伤程度较重的神经母细胞瘤细胞,CEPO也发挥了其较好的抗凋亡作用。CEPO组与EPO组相比,无明显的差异,提示CEPO对Bcl-2及caspase-8的调节作用与EPO是基本相同的。意义：本研究首次对氨甲酰基促红素对氧自由基损伤的神经母细胞瘤细胞的保护作用进行了研究,利用MTT法及乳酸脱氢酶测定等方法对细胞损伤的程度进行了研究,结果表明,CEPO对氧自由基损伤的神经细胞具有保护作用；且CEPO对凋亡的抑制参与了这种保护作用；利用荧光定量RT-PCR方法对Bcl-2基因及caspase-8的mRNA的表达进行了研究,结果显示：Bcl-2基因及caspase-8均参与了CEPO的神经保护作用,且证明CEPO对神经细胞抗氧自由基损伤的保护作用与EPO是基本相同的。