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烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)自1883年被发现以来,一直备受关注。TMV宿主范围广,能侵染十字花科、茄科、豆科、菊科等30多个科,达300多种植物,由其引起的病害严重影响了作物的质量和产量,造成重大的经济损失。TMV在烟田的发病率较高,烟草在幼苗期发病不仅会出现矮化现象,还会影响其正常生长,导致的经济损失高达50-70%。迄今尚未开发出非常有效的防治方法,因此寻找新型的具有环境友好性的抗病毒生物农药是防治策略之一。抗病毒蛋白亦属于生物农药,它不仅可直接商业化开发应用,并且可以通过转基因技术使其在作物中长期表达而产生活性。金针菇蛋白FTX271能体外钝化TMV的侵染且在转基因普通烟中能延缓和减轻症状,但其机理目前尚不清楚。本实验利用金针菇毒蛋白FTX271,通过农杆菌介导的转基因技术将其基因导入本氏烟中,结合蛋白质组学技术,探索FTX271蛋白在本氏烟中的表达水平及表达产物对TMV的抑制状况。利用农杆菌介导法将FTX271基因转入本氏烟,通过植物组织培养技术成功获得3株转基因植株,分别命名为N1、N2、N3。以野生型烟草为空白对照,将经RT-PCR验证阳性的N1株系的T1代进行蛋白质组测序,结果表明FTX271蛋白确实能在本氏烟中获得表达。转基因组较野生型烟草上调表达差异蛋白87个,下调表达差异蛋白79个,且差异蛋白大部分集中在叶绿体中(36.14%)。其中上调表达的差异蛋白包括:参与植物自身免疫的有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)和胼胝质;参与抗病反应的防御酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)以及多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,POL);参与系统获得抗性(Systemic acquired resistance,SAR)反应的病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein,PR)PR-10、几丁质酶;植物处于逆境胁迫下产生的应急代谢物海藻糖(trehalose),以及参与茉莉酸合成过程中的脂肪氧合酶(Lipoxygenase,LOX)。说明FTX271不仅能增强转基因烟草自身的免疫,促进抗病防御酶的表达,还能诱导产生SAR反应,同时也能诱导茉莉酸激素通路中关键蛋白LOX的上调表达,提高转基因植物的免疫能力。另外,利用KEGG通路对差异蛋白进行分析发现,亚麻酸通路上调明显,而亚麻酸作为茉莉酸(Jasmonicacid,JA)合成的前体物质,在植物的生长发育,抵抗生物胁迫和非生物胁迫中起着重要作用,推测FTX271蛋白能促进茉莉酸通路的表达,加强植物自身的防御能力。将植物瞬时表达载体p35s-30B-GFP分别侵染野生型和转基因本氏烟T1代发现,绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)在野生型本氏烟中在第3天明显表达,第3-8天表达逐渐增强,第8天能在新生的叶片和叶柄中明显观察到,说明TMV在第8天完成系统侵染。而在转基因烟草中,表达载体在第3天表达不明显,侵染后的第5天才明显观察到荧光,第5-8天表达量逐渐增强,且在第11天能在新叶和叶柄中观察到明显的荧光,TMV在转基因烟草中第11天完成系统侵染。说明转基因烟草能延缓TMV在植株中的表达和扩散,更进一步说明FTX271能增强转基因烟草的防御能力。利用TMV的瞬时表达系统同时侵染转基因型和野生型烟草,在侵染的第8天采样进行蛋白质组学分析。蛋白定量结果同样也检测到了 FTX271的表达。结合蛋白质组学通路分析发现,转基因烟草有11条通路发生显著变化,其中在上调表达通路内质网蛋白加工中,定量到了 class I sHSP和class II sHSP的上调表达。小热休克蛋白(small heat shock proteins,sHSP)是一类主要行使分子伴侣功能的蛋白,其能在逆境胁迫下协助蛋白复性,稳定蛋白的功能,提高植物的抗胁迫能力,推测FTX271蛋白能促进sHSP的表达上调,而这种上调可能与转基因烟草的抗TMV能力提高有关。另外,我们还发现光合作用通路下调表达,其中与电子传递链有关的oxygen-evolving enhancer protein 3-1蛋白和参与了 PS I反应中心复合体的构成photosystem I P700 apoprotein A1蛋白的下调表达显著,推测在感染TMV的第8天,转基因烟草可能通过激活sHSP通路来增强植株抗病能力,以此补偿TMV对光合作用的影响。本实验结合转基因技术与蛋白质组学,成功获得转FTX271基因的本氏烟,为研究FTX271抑制病毒机理建立平台。利用转基因本氏烟发现FTX271在没有病毒侵染时就能激活本氏烟的诱导抗性,增强转基因的抗逆性。另外,利用TMV的瞬时侵染后发现症状明显减缓而且推迟。蛋白质组学分析表明这种减缓和推迟TMV表达可能与sHSP的上调表达有关,sHSP可能参与修复了由TMV引起的与光合作用相关酶的活性,最终使得转基因植株在TMV侵染后花叶症状减轻。本次实验的蛋白质组学结果为探寻转基因对植物生长以及抗病性的影响提供理论依据。另外,转FTX271基因烟草的成功培育为烟草抗病品种的选育、病害防治奠定了重要的理论基础。