外泌体（Exosomes）是目前研究最热门也是较为深入的一种囊泡。外泌体广泛存在于多种体液之中,包括血液、尿液、唾液、羊水、乳液等。外泌体较易获取,可以选择性地富集其标记蛋白以及RNA,从而使得外泌体成为了一种非常具有吸引力的非侵入性疾病诊断手段。目前对外泌体的研究已经发现了多种疾病的生物标记物,对疾病的早期指导以及个体化治疗带来了新的希望。之前对尿液生物标记物的研究主要集中于尿液中的可溶性蛋白,尿液外泌体的发现和分离则将尿液生物标记物的研究推进了一个全新的研究阶段。但到目前为止,还没有统一的尿液外泌体分离方法,且尚未对尿液外泌体糖基化蛋白质组学的系统研究。本论文通过将基于超滤法分离尿液外泌体的方法与传统的尿液外泌体分离方法进行对比,体现了基于基于100 kDa超滤管提取尿液外泌体的优越性。并基于此方法,建立了稳定、高效的人尿液外泌体蛋白质糖基化分析策略,并对健康男女的尿液外泌体N-糖基化位点差异位点信息进行研究。本论文具体内容如下:第一章对外泌体,外泌体分离技术,尿液外泌体,蛋白质组学、N-糖基化修饰蛋白进行了简要综述。第二章通过对基于100 kDa超滤管分离尿液外泌体的方法与其它尿液外泌体分离方法包括试剂盒分离法、PEG6000沉淀分离法、PEG10000沉淀分离法进行评价。通过Western blot验证尿液外泌体自身标记物（TSG101,AQP2）的表达情况分析;通过TEM对尿液外泌体粒子的尺寸和形状进行分析;通过NTA测算和统计尿液外泌体的粒径分布范围;通过质谱鉴定技术对尿液外泌体蛋白质的表达谱进行鉴定分析;通过GO分析对尿液外泌体细胞成分进行分析。研究结果表明,通过超滤管法分离尿液外泌体是一种操作简便,经济有效,且可以处理大规模尿液样本的尿液外泌体分离方法。基于此分离方法成功从健康人尿液样本中分离富集到尿液外泌体,通过质谱鉴定共鉴定到1534个蛋白,并鉴定到ExoCarta数据库中100种外泌体标志蛋白质的97%。第三章基于100 kDa超滤管分离富集尿液外泌体蛋白,使用HILIC填料用于尿液外泌体N-糖基化蛋白的富集,并对健康男女的尿液外泌体N-糖基化位点的差异位点信息进行分析,建立了稳定、高效的人尿液外泌体蛋白质糖基化分析策略。该研究策略为:基于上述新方法分离出三男三女健康人尿液外泌体蛋白,对分离的尿液外泌体蛋白进行FASP酶切,然后使用HILIC填料用于尿液外泌体N-糖基化蛋白的富集。在该策略下,成功从健康男性尿液外泌体蛋白中鉴定到982个糖基化蛋白,从健康女性尿液外泌体蛋白中鉴定到1 189个糖基化蛋白,富集效率为78%。并通过火山图分析和热图分析对尿液外泌体N-糖基化蛋白数据的分析,从而得出健康男女的尿液外泌N-糖基化位点的差异位点信息。