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目的:肿瘤的快速筛查和治疗是当前医学界的难题,本研究旨在利用高灵敏度化学发光蛋白质芯片技术(iPDMS蛋白芯片),实现对低丰度的多种肿瘤相关标记物的高效筛选。分析筛选所得到的多种肿瘤相关性标志物,选择其中在8种常见肿瘤细胞中差异表达的CD20作为研究对象,设计和筛选CD20核酸适配体,探讨其检测肿瘤作用,为进一步利用CD20适配体在临床肿瘤靶向治疗奠定基础。方法:1.iPDMS芯片的制备和检测:在传统的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂,并通过热交联(硅氢键键合)固定到PDMS的三维结构中,得到一种新的材料即改性硅胶iPDMS。通过表面引发的原子转移自由基聚合反应(SI-ATRP)从活性引发位点处合成poly(OEGMA)高分子刷,即能得抗蛋白质非特异性吸附的iPDMS材料,利用喷点打印技术将肿瘤相关的抗原高通打印于芯片的特定区域,并组装成48孔的iPDMS芯片微孔板。应用iPDMS芯片对1152例临床常见肿瘤患者和192例体检健康者进行了两轮芯片筛查,检测血清样本的肿瘤相关的自身抗体。2.CD20核酸适配体的筛选:通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment,SELEX)筛选获得特异性和高亲合力结合肿瘤细胞表面分子标志CD20(Cluster of Differentiation,CD20)主要膜外区和胞质区片段CD20/486的ssDNA适配体(apatmers),检测和分析所筛选的CD20/486适配体的序列和构象;适配体与靶分子的结合能力以及病理组化染色中的应用,为进一步利用CD20/487适配体在临床肿瘤靶向治疗和诊断奠定基础。本研究先在基因库中查找到人源的CD20基因全序列,找到包括全部膜外区序列的近C端486bp的核苷酸序列,根据密码子简并性将部分密码子进行修改,使之能在原核中表达,再将CD20/486构建到pGEX-4T中,融合表达GST-CD20/486蛋白。运用SELEX技术对融合表达的GST-CD20/486蛋白进行筛选,并用GST蛋白进行反筛。实验首先构建一个长度为80bp含有40个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,PCR扩增为双链DNA(dsDNA)随机文库后,作为初始模板保存,用不对称PCR扩增出每轮筛选的ssDNA随机库作为下一轮筛选适配体库。经10轮筛选后,将ssDNA扩增成dsDNA,连接到T载体上,测序后利用DNAMAN软件对所测定的序列进行序列一级结构和二级结构分析及同源性比较;酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测单适配体与纯化的GST-CD20/486蛋白结合能力,流式细胞仪(FCM)检测单适配体与GST-CD20/486蛋白的亲和力。将亲和力最大的适配体用生物素标记后,用于临床肿瘤病理标本组化染色,用SABC试剂显色,同时做常规HE染色作为对照,确定筛选所得到的适配体用于肿瘤诊断的效果。结果:1.建立了用于肿瘤筛查的iPDMS芯片技术方法,检测1152例临床确诊的肿瘤样本,研究发现CD20、VEGF1、VEGF121和VEGF在常见8种肿瘤患者(乳腺癌、肺癌、直结肠癌、胃癌、肝癌、白血病、卵巢癌和淋巴瘤)中差异表达,血清中VEGF1、VEGF121和VEGF对应的抗体水平明显高于体检健康对照组,抗CD20抗体水平明显低于体检健康对照组,两者具有统计学意义(P<0.05)。2.将CD20蛋白C端486bp基因修改后,成功在原核细胞中表达并纯化出GST-CD20/486蛋白,并利用SELEX技术筛选得到特异性结合CD20/486的适配体。将第10轮筛选得到的适配体克隆到T载体得到22个单克隆的测序结果,命名为SW1至SW22,其中单适配体SW11表现出与CD20/486蛋白最强的的结合能力,解离常数(Kd)为28±6nM。3.生物素标记的单适配体SW11能与肿瘤病理切片中的肿瘤细胞CD20结合,CD20适配体在常见肿瘤中免疫组化结果阳性。结论:1.成功构建了一种化学发光标记的iPDMS蛋白芯片,可用于肿瘤相关的抗体或自身抗体的筛查。本研究在常见肿瘤筛查得到的CD20抗体可作为潜在的肿瘤标志物,可为肿瘤的诊断和机理分析提供切入点。2.本研究成功应用SELEX技术筛选得到与GST-CD20/486蛋白特异性结合的ssDNA适配体SW11,有望作为肿瘤检测的新型诊断试剂,并且为进一步进行临床靶向治疗奠定了基础。