甘蔗（Saccharum spp.）是最重要的糖料作物,占世界食糖总产的80%,占我国的90%以上。甘蔗起源于热带,经长期驯化主要在亚热带地区种植,新植和宿根发株均在冬末春初,期间以低温或低温与阴雨相伴天气为主,此时甘蔗正处于未萌动芽、萌动芽、芽苗或幼苗期,除未萌动芽外,均易受低温危害。研究甘蔗耐寒机制,挖掘冷响应基因,不仅对揭示植物耐寒性机理具有科学意义,对促进培育耐寒性甘蔗品种也具有重要的现实意义。目前,甘蔗响应低温胁迫的研究多集中在形态学、生理生化和表型,对分子机制的研究还较少。本文借助高通量测序技术,重点在转录组水平上研究甘蔗对低温胁迫的应答,并利用生物信息分析、生理生化分析、亚细胞定位、基因克隆、基因定量检测、基因瞬间表达、细胞活体染色等技术方法的综合应用,挖掘冷响应基因miRNA和mRNA,有助于从整体上揭示甘蔗响应低温胁迫的分子调控网络,并为耐寒性育种提供新的基因资源。主要结果和结论如下:1.甘蔗miRNA内参基因的评价与筛选。以低温处理的甘蔗芽为材料,采用四种内参基因评价软件,评价了 17个候选内参基因效果,并以2个已知冷响应miRNA定量检测进行验证,筛选出最佳内参基因组合miR171/18S rRNA和miR171/miR5059,最优的单个内参基因miR171和18S rRNA。本研究筛选了适用于miRNA定量检测的内参基因,此工作为甘蔗中的首次报道,为甘蔗miRNA定量检测提供了适用的内参基因,也为探究miRNA在甘蔗响应低温胁迫过程中的功能奠定基础。2.甘蔗萌动芽响应低温胁迫的miRNA转录组研究。采用高通量测序技术,解析了耐寒性不同的2个甘蔗品种萌动芽响应低温处理3 h的miRNA表达谱。甘蔗萌动芽测序获得412个miRNAs,其中有62个差异表达的miRNAs。鉴于miRNA是通过调控靶基因发挥作用,本研究挖掘出对应于202个已知miRNAs的2,805个预测靶基因。对差异表达的miRNAs的靶基因进行功能注释,可知miRNA通过调控候选靶基因参与多个与植物响应低温胁迫有关的代谢途径。发现植物激素信号途径是植物响应低温胁迫的重要部分,有较多的miRNA参与其中。基于转录组分析和定量PCR检测结果发现低温、干旱和盐胁迫明显影响甘蔗miR156的表达,其前体基因MIR156在烟草中进行瞬时过表达,发现低温胁迫后,转基因烟草生长状态优于对照,表现在:植株柔软萎蔫程度较轻,H2O2含量累积较少,花青素含量较高,且冷诱导基因的上调程度较高,说明miR156在植物抵抗低温胁迫中起积极作用,推测miR156是通过控制靶基因SPL,促进花青素的积累,从而最终增强植株的耐寒性。3.甘蔗叶片响应低温胁迫的miRNA转录组研究。低温处理甘蔗幼苗0d、2d和4 d,发现2d后不耐寒品种蔗叶枯黄萎蔫,4d后耐寒品种也接着出现,两品种叶片中的叶绿素含量降低,电导率和丙二醛含量升高,游离脯氨酸和抗氧化酶活性增强,冷抗性基因被低温诱导表达,表明了长时间低温对甘蔗的多层面不利影响。RNA-seq共得到144个miRNAs,其中32个为差异表达的miRNAs。与短时间（3 h）低温处理的萌动蔗芽相比,所挖掘到的miRNA数量较少,暗示了某些miRNAs的表达具有一定的时空特异性。此外,还预测到对应于117个miRNAs的1,138个候选靶基因,差异miRNA的靶基因功能注释表明其主要与植物信号等代谢有关。结合转录组分析和定量PCR验证结果发现miR393在耐寒品种FN39中可被低温诱导表达,而在不耐寒品种ROC22中则被抑制表达,暗示了其可能为重要的冷响应基因。将miR393在拟南芥中稳定过表达后,发现经长期低温处理后,与野生型相比,转基因植株叶片变紫稍早,MDA和H2O2含量均较低,花青素、游离脯氨酸含量和抗氧化酶活性均较高,冷抗性基因的诱导程度也较高,说明转基因拟南芥的耐寒性优于野生型。此外,转基因系抽苔更早,薹茎更高。结合拟南芥转录组测序分析和相关基因的定量PCR检测结果,推测了miR393在植物响应低温胁迫过程中的作用机制,即本身参与生长素信号途径的miR393也可能在乙烯信号途径中起作用。低温在植物体内对miR393的诱导,使得乙烯信号途径受到抑制,而受抑制的乙烯信号则会促进花青素在体内的积累、加速抽苔的发生和诱导冷抗性基因的表达,最终提高了植株的耐寒性。4.甘蔗低温胁迫下mRNA转录组研究。采用高通量测序方法,获得了幼苗低温胁迫前后2 d的甘蔗叶片mRNA转录组。共鉴定出270,451个unigenes,大大丰富了现有的甘蔗基因资源。差异基因表达分析发现,在FN39和ROC22中分别有11,574和13,340个差异表达基因,部分表现出品种特异性。对其进行功能注释,发现均参与多个代谢途径,但存在差异,尤其是碳代谢途径,推测可能是造成两个品种耐寒性不同的原因。ScG6PDH是甘蔗糖代谢中的关键酶,亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中,为胞质型G6PDH家族中的成员。定量PCR检测表明,ScG6PDH可被低温、重金属、盐和干旱胁迫诱导表达,其中对低温胁迫和重金属的响应最为强烈。酶活性测定表明,上述四种非生物胁迫可致ScG6PDH的酶活性增强,基本与转录水平的变化趋势保持一致。此外,ScG6PDH在烟草叶片中瞬时表达后的分析结果,也间接证明其参与了植物响应逆境胁迫的防御反应。