VB12是一种重要的生物活性物质，广泛应用于医药、食品和畜牧业，它可以用来治疗恶性贫血症，同时它也是许多微生物和动物的生长因子。脱氮假单胞杆菌是近年来兴起的用于好氧合成VB12的工业菌种，具有生长快而且产率高的优势。目前国内外对VB12研究一方面集中在分子基因水平的机理研究，另一方面集中在发酵条件或调控策略改变的工艺研究，但由于条件所限，尚不清楚脱氮假单胞杆菌的中心代谢和合成代谢如何受到各种因素的影响，因此，很有必要从代谢通量的角度去考察VB12发酵过程，并利用这些研究结果进一步提高VB12的产量。 本文首先通过逐次删除因子实验找到了影响脱氮假单孢菌生长和产物合成的关键因子：蔗糖、(NH4)2HPO4、KCl、MgSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O和Na2MoO4·2H2O；在此基础上进行了正交设计和均匀设计实验，分别得到了合成种子培养基和合成发酵培养基，为下一步进行MFA提供了基础。 利用上述合成培养基，本文研究了常规代谢通量分析(MFA)方法在VB12发酵过程中的应用，分别对VB12合成前期55-60h和合成中期105-110h的细胞代谢通量进行了分析，发现随着VB12合成速率的增快，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化生成草酰乙酸(OAA)的通量明显加大，以满足VB12合成对前体的需求。根据该分析结果，对发酵工艺进行了改进，即在脱氮假单胞菌进入合成VB12阶段时，提高发酵罐的罐压，增加发酵液中二氧化碳的溶解度，从而强化了羧化回补途径。实验结果显示，与原工艺相比，VB12的效价提高了近20％。 为了能更精确地掌握VB12发酵过程中代谢通量的变化情况，本文进一步建立了基于13C标记试验的代谢通量分析(13CMFA)方法，包括代谢网络的构建、标记实验的设计和实施、通过GC-MS获取蛋白氨基酸的13C标记丰度信息的分析方法的建立和相应的数据处理算法的设计等，成功地在VB12发酵过程中实施了基于13C标记试验的代谢通量分析。在此基础上研究了甜菜碱在细胞生长和产物合成中的作用，比较了在培养基中添加甜菜碱和不添加甜菜碱两种条件下的胞内代谢通量分布情况，获得了代谢网络中关键节点的代谢通量比率数据，发现在添加了甜菜碱的培养基中，细胞生长时不仅会消耗甜菜碱用于菌体碳架的构建，而且高浓度的甜菜碱会对细胞生长产生抑制作用；只有进入产物合成期以后，甜菜碱分解生成的GLY才更多地用于VB12前体ALA的合成。根据13CMFA的分析结果，对发酵工艺进行了改进，将原生产工艺中初始培养基中的甜菜碱的浓度由原来的14g/L降低到6g/L。实验结果显示，尽管甜菜碱用量减少了27％，节约了生产成本，但细胞最大比生长速率μm提高了14.5％，明显增加了稳定期的菌浓，从而使VB12的效价提高了7.1％。