将制备的兔抗人MMP-11(Matrix Metalloproteinase-11，MMP-11)多克隆抗体进行纯化，验证抗MMP-11多克隆抗体纯化前后的效果。运用免疫印迹(Western blot)法检测月经血痕、外周血痕、阴道液斑、精液斑、唾液斑、尿液斑的MMP-11蛋白，并进行月经血痕的MMP-11灵敏度分析，盲测验证该方法的可靠性；通过免疫组织化学染色方法检测MMP-11蛋白，区分月经血与阴道液。以期建立用MMP-11抗体快速、准确检测月经血的免疫学方法，解决常规月经血检测方法的局限性，以及RT-PCR技术操作繁琐耗时，不利于实践中快速检测的缺陷，为解决检测月经血的难题建立一种实用的方法。 一、抗人MMP-11多克隆抗体的纯化与鉴定 本课题组前期已成功制备了兔抗人MMP-11多克隆抗体，本试验采用饱和硫酸铵盐析沉淀法对其进行纯化。运用免疫印迹法和Bradford蛋白定量法对纯化前后的兔抗血清进行鉴定，结果在相对分子量(Mr)为45.5×10<3>道尔顿处，检见目的条带，抗MMP-11抗体经纯化后纯度明显提高。 二、免疫印迹法检测 斑痕MMP-11收集各种斑痕标本，包括月经血痕(n=30)、阴道液斑(n=36)、外周血痕(n=30)、精液斑(n=17)、唾液斑(n=25)、尿液斑(n=20)，提取总蛋白并进行Bradford蛋白定量，采用Western blot方法以1:1000稀释的纯化抗血清作为一抗检测MMP-11；收集2例MMP-11检测阳性的月经血，制成定量血痕，进行灵敏度检测；分别研究MMP-11检测阳性月经血痕于4℃、室温(20℃-33℃)下放置天数对检测结果的影响；将外周血和MMP-11阳性的月经血痕共6例，单盲法进行测定。结果：①月经血痕MMP-11蛋白的检测阳性率为90.48﹪(93/105)，前4天的月经血痕检测率差异无显著性意义；②外周血痕、精液斑、唾液斑、尿液斑、阴道液斑均未检出MMP-11，显示出明显的器官特异性；③灵敏度实验结果提示月经血蛋白含量≥39.76μg(血液量1～1.5μl)时便可有效测出其中所含MMP-11抗原；④干燥环境下月经血痕中MMP-11抗原的抵抗力较强， 4℃保存一年检出阳性率为91.67﹪(11/12)，20～33℃保存的MMP-11阳性血痕能正确检测的最长时限为20周；⑤4例盲测样本结果与已知比对，结果正确。提示所建立的方法用来检测斑痕：MMP-11较特异可靠，可用于检测陈旧月经血痕MMP-11抗原。 三、免疫组织化学染色检测 MMP-11将健康志愿者的新鲜月经血及阴道液分别涂片，同时将室温放置1月的陈旧月经血痕进行沉渣涂片，采用链霉卵白素.碱性磷酸酶(SAP)免疫组化法检测MMP-11，以自制纯化抗血清作为第一抗体，生物素标记羊抗兔IgG为第二抗体。结果新鲜月经血涂片可见分散、着染为紫黑色的子宫内膜细胞，阴道液涂片未见阳性染色，陈旧月经血痕沉渣涂片染色后罕见完整细胞，特异信号微弱，无法判断结果。表明免疫组化方法能检测月经血的MMP-11蛋白，但不适宜检测月经血痕中的MMP-11，同时表明阴道液不含.MMP-11。 结论：自制的抗．MMP-11多克隆抗体具有较强的组织特异性。所建立的Western blot法能检测月经血中的：MMP-11，可用于月经血及外周血、阴道液、精液、唾液、尿液等常见斑痕的鉴别，具有应用于法医实际检案的广阔前景。