研究背景目前,继发性腹膜炎出现严重腹腔感染的患者占医院所有就诊人数的1%,任何形式的弥漫性腹膜炎是诱发腹腔脓毒症的高危因素,死亡率高达7.6%～36.0%。由于腹腔及其所含空腔脏器具有独特的解剖生理和微生物学特征,导致严重腹膜炎诱发脓毒症发病率较高,已成为全球脓毒症的第二大病因。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）在肠道异位定植能促进抗生素抗性基因转移至肠道共生微生物中扩增,极大增加了诱发MRSA相关结肠炎的风险。然而抗生素等标准疗法治疗后又会引发持久的肠道微生态紊乱,有益菌群产生定植抵抗,有害菌群伺机增殖,患者易并发脓毒性休克与多器官功能衰竭。因此,研究通过改变感染后机体适应能力进而应对病原体侵袭的新策略无疑具有重要的临床意义。弥漫性腹膜炎诱发腹腔脓毒症导致肠道屏障完整性受损,主要表现为肠道粘膜层通透性增强,肠粘膜灌注紊乱,组织水肿,细菌易位伴肠道菌群失调。重症腹腔脓毒症患者肠上皮细胞功能破坏是引发脓毒性休克与多器官功能障碍综合征的关键因素,主要是肠上皮单层细胞（intestinal epithelial cells,IEC）暴露于肠腔内大量毒物因子,导致IEC细胞间紧密连接破坏,有害大分子和病原体跨过上皮屏障侵入粘膜下层。微生物物种之间,微生物共生体与宿主细胞之间通过多种宿主-微生物互作代谢轴调节肠道屏障功能。然而在MRSA诱导腹腔脓毒症期间,肠道微生物组出现何种紊乱现象,肠腔内病原菌如何损伤肠上皮细胞（Enterocytes）紧密连接,此过程涉及哪些宿主-微生物群代谢交互作用均有待阐明。CYP1A1基因编码细胞色素P4501A1,通常AHR与其配基结合后通过异二聚效应结合ARNT组成XRE复合体激活CYP1A1基因。CYP1A1在体内可将多种异生物质转化为细胞毒素,能通过C2端羟基化作用参与体内雌激素代谢,也可通过其羟化酶活性介导花生四烯酸代谢为12（S）-HETE。本课题组前期发现,脂多糖与大肠杆菌诱导的腹膜炎小鼠腹腔巨噬细胞Cyp1a1基因与蛋白表达水平显著升高,同时检测到脓毒症患者外周血单个核细胞CYP1A1的异常活化与SOFA评分呈正相关。另外,肠道中FICZ/AHR/CYP1A1的昼夜反馈通路在肠道菌群的参与下对维持肠稳态具有重要作用。加之肠道微生物群的组成和功能又受到昼夜节律的调节,导致啮齿动物肝脏和肺脏中CYP1A1蛋白表达水平与酶活性也存在昼夜波动。以上提示CYP1A1与肠道微生物群之间可能存在明显的生物串扰效应,然而宿主CYP1A1-肠道微生物代谢轴是否参与介导了腹腔脓毒症肠屏障损伤尚未获得证实,CYP1A1是否依赖其羟化酶活性调控IEC紧密连接蛋白的表达尚待揭示。此外,AHR非基因组调控靶点多在细胞浆或细胞膜上,在改善肠道菌群与维持肠道健康方面是否存在其他AHR非依赖性的微生物调控靶点,迄今未见文献报道。在MRSA诱导的腹腔脓毒症模型中,CYP1A1和微生物群介导的信号传导互作是否独立于AHR调控尚待阐明。研究目的探讨MRSA腹腔脓毒症小鼠回肠CYP1A1异常表达损伤肠上皮屏障的机制;探究“CYP1A1-肠道微生物尸胺代谢-紧密连接”轴在肠屏障功能障碍中是否独立于AHR的调控;明确CYP1A1是否依赖其羟化酶活性下调紧密连接蛋白ZO-1的表达。研究方法1.MRSA诱导AS小鼠回肠上皮CYP1A1表达及其对IEC紧密连接完整性的影响建立MRSA诱导AS小鼠模型,体外分离培养野生型C57BL/6J小鼠在MRSA腹腔感染前、后的原代回肠上皮细胞,采用qRT-PCR法、Western blot法、IF技术、EROD酶活性检测法动态评估小鼠腹腔感染MRSA前、后回肠上皮细胞CYP1A1的表达与酶活性变化规律。构建Cyp1a1基因敲除小鼠,采用FITC-葡聚糖渗透性测定法、qRT-PCR法、Western blot法、IF技术、透射电镜技术评估Cyp1a1基因敲除小鼠及其同窝野生型对照小鼠在腹腔感染MRSA前、后肠道通透性与回肠上皮紧密连接完整性。2.MRSA腹腔脓毒症时CYP1A1介导肠菌尸胺代谢损伤肠上皮紧密连接建立MRSA诱导AS小鼠模型,借助Cyp1a1基因敲除小鼠及其同窝野生型对照小鼠,采用回肠组织转录组测序技术、UHPLC-MRM-MS/MS尸胺定量检测技术、小鼠赖氨酸脱羧酶（LDC）活性测定法、小鼠盲肠内容物中Ldc C与Cad A基因检测法、16S rDNA高通量测序技术、qRT-PCR法、Western blot法、IF技术等实验,明确“CYP1A1-肠菌尸胺代谢-紧密连接”轴在MRSA诱导腹腔脓毒症小鼠肠上皮屏障损伤中的作用。分别收集感染MRSA的脓毒症患者与健康志愿者血清与粪便标本,采用UHPLC-MRM-MS/MS技术与DAO酶活性测定法检测尸胺含量与肠屏障通透性,探究感染MRSA的脓毒症患者体内尸胺含量与疾病严重度的关系。建立Cyp1a1基因敲除小鼠与Ahr基因敲除小鼠同笼饲养模型,采用UHPLC-MRM-MS/MS技术、Western blot法、IF等实验,探讨Cyp1a1基因敲除小鼠抵御腹腔脓毒症肠屏障损伤时的“肠道微生物代谢-紧密连接”途径是否具有独立于AHR的调控作用。3.CYP1A1通过非羟化酶活性依赖方式下调紧密连接蛋白ZO-1的表达建立尸胺（CAD）、小鼠粪便上清提取液（FS）与TNFα三种体外诱导肠上皮损伤模型,采用qRT-PCR法、Western blot法、EROD法动态评估MODE-K细胞与Caco-2细胞在损伤刺激前、后CYP1A1的表达与酶活性变化规律。构建CYP1A1过表达、敲除、羟化酶位点突变的MODE-K细胞株,构建CYP1A1敲低的Caco-2细胞株,采用跨上皮电阻TEER法与荧光素细胞旁转运实验FITC法检测肠上皮细胞通透性;采用qRT-PCR法、Western blot法、IF技术检测紧密连接分子ZO-1与claudin-4的表达。借助转录因子公共数据平台,使用JASPAR数据库预测转录因子RUNX1与紧密连接分子Tjp1的结合位点,采用EMSA方法检测CYP1A1敲除后RUNX1与Tjp1启动子的结合活性。野生型C57BL/6小鼠尾静脉注射si RNA构建体内Cyp1a1基因敲低模型,采用FITC-葡聚糖渗透性测定法、UHPLC-MRM-MS/MS技术、Western blot法、透射电镜技术,验证“CYP1A1-肠菌尸胺代谢-紧密连接”轴在MRSA诱导腹腔脓毒症肠上皮屏障损伤中的作用。研究结果1.MRSA诱导AS小鼠回肠上皮CYP1A1表达及其对IEC紧密连接完整性的影响1.1小鼠腹腔感染MRSA后,qRT-PCR、Western blot与IF均检测到回肠上皮细胞中CYP1A1表达增加;小鼠腹腔感染MRSA前、后回肠上皮细胞CYP1A1羟化酶活性无统计学差异。1.2在MRSA诱导AS模型中,Cyp1a1基因敲除小鼠(Cyp1a1-/-)的生存率显著高于其同窝野生型对照小鼠(Cyp1a1+/+)。Cyp1a1+/+＿MRSA组小鼠表现出严重腹泻,回肠组织水肿膨大并伴有脓液渗出,而Cyp1a1-/-＿MRSA组小鼠仅观察到肛周粘便现象。1.3与Cyp1a1-/-＿MRSA小鼠相比,Cyp1a1+/+＿MRSA小鼠检测到肠道通透性显著升高,外周血细菌载量显著增加;qRT-PCR、Western blot与IF技术检测到紧密连接分子表达下调;透射电镜技术观察到紧密连接结构破坏、缝隙增宽。2.MRSA腹腔脓毒症时CYP1A1介导肠道菌群尸胺代谢损伤肠上皮紧密连接2.1回肠组织RNA-seq分析显示,Cyp1a1-/-＿MRSA小鼠相比Cyp1a1+/+＿MRSA小鼠,机体对细菌的防御反应通路显著上调,赖氨酸代谢通路显著下调。分别检测小鼠盲肠内容物与血清以及感染MRSA的脓毒症患者粪便与血清中的尸胺含量。结果显示,MRSA感染的Cyp1a1+/+小鼠与脓毒症患者体内尸胺含量异常增高,并且MRSA感染伴有“肠漏”的脓毒症患者粪便尸胺含量与SOFA评分呈正相关。2.2与Cyp1a1-/-＿MRSA小鼠相比,Cyp1a1+/+＿MRSA小鼠盲肠内容物中促进赖氨酸代谢为尸胺的关键酶LDC活性显著升高,肠道菌群编码LDC的Ldc C与Cad A基因表达丰度显著升高。盲肠内容物16S rDNA高通量测序分析显示,Cyp1a1-/-＿MRSA小鼠产尸胺微生物分类群（Enterococcus faecalis与Escherichia shigella）的相对丰度明显少于Cyp1a1+/+＿MRSA小鼠,提示敲除Cyp1a1基因可缓解MRSA腹腔感染时的菌群失衡。2.3对Cyp1a1-/-小鼠灌胃商品化尸胺后再经MRSA腹腔感染,检测到回肠上皮紧密连接分子ZO-1（Tjp1）基因表达水平显著降低,肠道通透性显著增加;对Cyp1a1-/-小鼠灌胃商品化E.faecalis菌株后,在MRSA腹腔感染24小时内全部死亡,伴随肠道通透性显著升高,紧密连接分子ZO-1（Tjp1）与Occludin（Ocln）m RNA水平显著降低,回肠上皮病理损伤严重,盲肠内容物中尸胺含量显著升高。Cyp1a1-/-小鼠在四联抗生素灌胃干扰菌群后,对MRSA腹腔感染的生存保护效应消失,伴随尸胺含量升高,紧密连接ZO-1表达降低,回肠上皮细胞结构破坏。2.4与Cyp1a1-/-＿MRSA小鼠相比,Cyp1a1+/+＿MRSA小鼠回肠上皮HRH4受体表达上调;IEC中MLCK和p-MLC2蛋白表达显著增加,ZO-1与E-cadherin表达显著降低;IEC胞核p65与胞浆phospho-IκBα表达水平显著增加。HRH4拮抗剂JNJ7777120显著逆转了上述效应,提示Cyp1a1+/+＿MRSA小鼠回肠腔内积聚的尸胺可通过激活HRH4/NF-κB/MLCK通路损伤肠上皮紧密连接。2.5 Ahr-/-小鼠与Cyp1a1-/-小鼠同笼饲养10周后经MRSA腹腔感染,回肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和E-钙黏蛋白E-cadherin表达水平显著增加,肠内容物中尸胺含量降低。提示虽然AHR在维持肠道免疫抵御肠源性感染方面具有重要作用,但Cyp1a1-/-小鼠腹腔脓毒症时肠道微生物代谢通路可能具有独立于AHR的调控作用。3.CYP1A1通过非羟化酶活性依赖方式下调紧密连接蛋白ZO-1的表达3.1 CAD、FS与TNFα三种体外诱导肠上皮损伤模型均能在两种肠上皮细胞MODE-K与Caco-2中诱导CYP1A1基因表达上调,羟化酶活性变化无统计学差异。3.2与CYP1A1过表达、羟化酶位点突变的细胞株相比,CYP1A1敲除细胞株在CAD与TNFα处理后显著改善肠上皮细胞通透性,显著提高紧密连接蛋白ZO-1与Claudin-4的基因与蛋白表达水平。3.3预测转录因子RUNX1与靶基因Tjp1（ZO-1）的结合位点。相比Cyp1a1-High与Cyp1a1-Mu组,仅观察到Cyp1a1-KO组RUNX1在CAD处理后与Tjp1启动子结合。3.4野生型C57BL/6小鼠CYP1A1 si RNA体内系统给药可缓解MRSA腹腔脓毒症致肠上皮紧密连接损伤,改善肠屏障功能,降低肠腔尸胺含量,延长小鼠生存时间。结论Cyp1a1基因敲除小鼠在应对MRSA腹腔脓毒症致肠上皮屏障损伤中具有潜在的保护作用,可改善MRSA腹腔感染诱导的肠菌失调,显著减少肠腔E.faecalis与E.shigella丰度,降低有害代谢产物尸胺积聚,缓解肠上皮紧密连接的结构降解。并且“CYP1A1-肠道微生物尸胺代谢-紧密连接”途径在肠屏障功能障碍中具有独立于AHR的调控作用。此外,CYP1A1不依赖其羟化酶活性而抑制转录因子RUNX1与紧密连接分子Tjp1启动子结合,下调紧密连接蛋白ZO-1的表达。