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实验室前期研究结果表明,玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)能够合成DHN黑色素且与致病力密切相关,并克隆了黑色素合成途径中的2个HN还原酶基因(St3HNR和St4HNR)。为进一步明确HN还原酶基因在玉米大斑病菌黑色素合成中的作用以及2个HN还原酶基因相互间的关系,本研究利用基因敲除技术创制了St4HNR基因缺失突变体和St3HNRSt4HNR双基因缺失突变体,通过对突变体进行分析,明确基因功能。
以质粒pBS为敲除载体,抗生素G418为抗性筛选指标,构建St4HNR基因敲除载体。利用聚乙二醇(PEG)介导法将构建好的基因敲除载体转化玉米大斑病菌野生型菌株01-23和St3HNR基因缺失突变体菌株的原生质体中,经G418筛选,PCR特异引物验证得到St4HNR单基因缺失突变体和St3HNRSt4HNR双基因缺失突变体。
对突变菌株进行表型分析,结果发现,△St4HNR突变体菌落正面呈白色,背面黑褐色,较野生型菌株颜色浅;△St3HNR△St4HNR双基因缺失突变体菌落正面呈白色,背面呈浅红棕色,较△St4HNR突变菌株菌落颜色还要浅。本实验前期获得△St3HNR菌株,颜色均深于△St4HNR和△St3HNRASt4HNR菌株,可初步推测,St4HNR缺失后,St3HNR可能在。DHN黑色素生物合成第一步脱氢反应中起作用。与野生型菌株相比,突变菌株的生长速度快,菌丝透明但呈不规则状,不产生分生孢子,△St4HNR菌株黑色素的含量降低至16.5μg/g,而△St3HNR△St4HNR菌株黑色素的含量降低至4.7μg/g。△St3HNR△St4HNR双基因缺失突菌株的菌丝经诱导不产生附着胞,△St4HNR菌株附着胞的膨压约为4.32 Mpa,明显低于野生型附着胞的膨压(5.45Mpa);△St4HNR菌株的附着胞形成以及穿透能力比野生型推迟12 h,穿透率降低至42％。由此可知,St3HNR,St4HNR的缺失抑制玉米大斑病菌DHN黑色素合成,降低了病菌附着胞膨压,从而导致侵染效率下降。