桃(Prunus Persica(L.)Batsch.)因其营养丰富、风味独特在园艺产业中占据重要地位。桃果实的品质受多种因素影响,如光合产物的转化和积累。蔗糖作为碳水化合物的主要存在形式,在源叶合成后经过韧皮部的运输到达各库器官,如果实中。桃果实的品质和产量很大程度上取决于所含碳水化合物的种类和数量。蔗糖转运蛋白作为碳水化合物装载进韧皮部,且从合成部位运输到有需求组织部位的主要介质,负责蔗糖的装载、卸载和分配。通过研究蔗糖转运蛋白的作用机制,可以帮助理解决定果实生长和品质的蔗糖积累的过程。因此,对植物蔗糖转运蛋白的深入探索研究是很有必要的。该试验在本课题组的研究基础上,从桃中克隆出桃蔗糖转运蛋白家族的3个成员PpSUT1,PpSUT2和PpSUT4,利用缺陷型酵母对其进行功能验证,通过对PpSUT2进行原核表达,制备了多克隆抗体,并对桃各组织中PpSUT2的蛋白表达进行分析,为基因的免疫细胞定位、蛋白质互作因子等研究提供了重要依据。主要作了如下几项研究:1.桃SUTs的克隆和序列分析从桃中克隆出其蔗糖转运蛋白家族基因PpSUT1(KU230443),PpSUT2(KJ152144)和PpSUT4(KU198999)分别与桃基因组序列ppa004033m,ppa003041m和ppa004620m相一致。此处得到的PpSUT2基因含有长度为1830bp的ORF,比此前克隆的PpSUT2(1782bp)多出47个碱基,编码长度为609个氨基酸的蛋白质。2.桃SUTs在酵母中的功能分析通过构建酵母表达载体,将桃的3个SUT基因在具有蔗糖吸收缺陷的酵母菌株SUSY7/ura3中进行异源表达,PpSUT1、PpSUT2和PpSUT4在SD-蔗糖培养基上都表现出了功能的互补,表明这3个桃蔗糖运蛋白基因都分别编码一个具有蔗糖转运活性的功能性蛋白。3.桃PpSUT2的原核表达及抗体制备根据PpSUT2基因的ORF序列,构建p ET32a-PpSUT2重组质粒,在表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中经IPTG诱导表达,所得到融合蛋白的分子量约为84k D。以纯化的PpSUT2-His蛋白为抗原进行兔免疫,用间接ELISA对抗血清进行效价检测,其效价达到了1:12800,Western blot分析显示该抗体能特异性识别PpSUT2融合蛋白,表明制备的PpSUT2多克隆抗体具有较高的检测灵敏度和特异性。4.桃PpSUT2的蛋白组织特异性表达提取桃不同组织的总蛋白,进行Western blot检测,在分子量84kD左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗体可以特异性识别桃PpSUT2蛋白,并且在桃的各个组织器官中都检测到了PpSUT2蛋白的表达,通过分析PpSUT2蛋白的表达模式,推测其功能是在果实发育期负责韧皮部蔗糖的转运和卸载,还有可能起到信号蛋白的功能。