论文部分内容阅读
氨基酸作为重要的有机小分子参与各项生命活动,既可合成蛋白质、脂质,又是调节细胞生长与分化、增殖与自噬等细胞代谢的关键信号分子。氨基酸作为外源信号可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)等来调控细胞代谢。Na~+偶联中性氨基酸转运蛋白2(sodium-coupled neutral amino acid transporter 2,SNAT2)是溶质载体转运蛋白,可转运蛋氨酸(methionine,Met)、亮氨酸(leucine,Leu)等中性氨基酸进入细胞,并在奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中高表达,促进BMECs乳合成,但其具体机理尚不清楚。实验室前期研究发现,SNAT2可以介导Met参与调节BMECs乳合成,而在泌乳过程中,BMECs的乳合成与细胞增殖、自噬及凋亡均相关,但其具体机理有待进一步研究。本研究将拟揭示Met调节BMECs乳脂合成、细胞增殖及自噬的分子机理,为进一步研究Met在乳生产中的重要作用提供实验依据。本研究以组织块法培养的BMECs为研究对象,免疫荧光结合Western blotting来鉴定BMECs中角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)与β-酪蛋白(β-casein)的表达,证明获得纯化、可泌乳的体外培养BMECs。向体外培养的BMECs分别添加0、0.3、0.6、0.9和1.2 mM的Met,BODIPY染色及甘油三酯(triglyceride,TG)检测发现,随着Met浓度的增加,BMECs中脂滴及TG含量逐渐增加,并且在Met浓度为0.6 mM时达到峰值,随后下降。结果表明Met以剂量依赖性方式促进乳脂肪合成;CASY细胞计数及流式细胞仪检测细胞数和细胞周期变化,发现随着Met浓度增加,细胞数及S期和G2/M期的细胞比例逐渐增加,并且在Met浓度为0.6 mM时达到峰值,随后降低。结果表明Met以剂量依赖性影响BMECs增殖及细胞周期;Western blotting检测相关蛋白表达变化,结果发现p-mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的蛋白水平显著增加,在Met浓度为0.6 mM时最高,随后逐渐下降。结果说明Met对mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信号传导途径的激活也具有剂量依赖性,添加0.6 mM的Met为最适浓度,过量的Met可能具有细胞毒性。为了研究Met对BMECs自噬的影响,Western blotting检测SNAT2抑制后自噬标志蛋白LC3-I/II表达量的影响,并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-II)变化。结果显示,SNAT2抑制时,p-mTOR表达量下降,LC3-II表达量增加,免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖(trehalose,Tre)和Met后,Met组同Met+Tre组比较,p-mTOR表达量增加,LC3-II表达量降低,自噬斑点减少;添加Tre和Met并抑制SNAT2时,p-mTOR表达量下降,LC3-II表达量增多,自噬斑点增多。以上结果表明Met通过SNAT2抑制自噬。SNAT2基因进行过表达和干扰表明SNAT2可以正向调节BMECs中甘油三脂的分泌和脂滴的形成,Western blotting检测结果表明SNAT2过表达可以上调p-mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的蛋白水平,而干扰SNAT2后,结果与过表达相反。表明SNAT2是mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的上游信号分子,并可正向调节乳脂肪合成和细胞增殖。为了研究Met调节SNAT2表达的分子机制,添加PI3K抑制剂-渥曼青霉素(Wortmannin,Wm)抑制PI3K信号通路的同时过表达SNAT2,Western blotting检测发现,PI3K抑制消除了SNAT2过表达对p-mTOR、SREBP-1c以及Cyclin D1的蛋白质水平的刺激。PI3K抑制实验表明,SNAT2激活mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信号通路需要PI3K激活。添加0.6 mM的Met同时抑制SNAT2,结果表明SNAT2敲低显著抑制Met对p-PI3K、p-mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的蛋白质水平的上调作用。Western blotting结合qRT-PCR检测发现,0.6 mM Met处理显著增加BMECs中SNAT2的蛋白质水平和mRNA水平,免疫荧光检测发现0.6mM Met处理显著增加SNAT2的细胞质定位。这些数据表明,Met通过SNAT2-PI3K调节mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信号通路。综上所述,Met剂量依赖性调节mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的表达,过量的Met对细胞具有毒性,Met通过SNAT2-PI3K途径调节mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1信号通路,从而影响BMECs乳脂肪合成、细胞增殖与自噬。