研究背景与目的近年来,随着碳青霉烯类药物的大量广泛使用,碳青霉烯耐药的革兰阴性超级细菌检出率越来越高,成为临床感染治疗面临的重要难题,其耐药机制研究已成为全球关注的热点。细菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制复杂,其中产能灭活碳青霉烯类抗生素的碳青霉烯酶是最重要的原因。细菌耐药性迅速产生及扩散的最主要原因是耐药基因的水平转移,耐药基因得以在同种或不同种属的细菌间广泛传播是通过多种机制实现的,如接合性质粒、转座子、整合子或插入序列共同区(ISCR)等可水平转移的基因元件。目前国内外的研究,主要集中在可携带多种耐药基因盒的整合子和可携带多种耐药基因盒且传播能力更强的插入序列共同区(ISCR1)上。本研究主要对临床分离的G-杆菌超级细菌进行常见碳青霉烯酶基因检测,对常见可移动耐药元件Ⅰ类整合子和ISCR1进行检测,了解他们在超级细菌中的分布及结构特征,探讨超级细菌的耐药机制。对重要菌株如NDM和KPC型的超级细菌进行基因定位分析,并对KPC型超级细菌进行MLST和基因环境分析,以了解耐药基因水平转移方式。另外,本研究特别针对两个水解谱广、水解功能强的重要基因NDM和KPC,建立一种快速、敏感、特异的双重荧光定量PCR方法,能在单一体系同时检测NMD和KPC。研究方法1.菌株选取和药敏实验及模板DNA制备收集南方医科大学南方医院检验科微生物室2011年7月至2012年7月临床分离的来自不同科室不同标本类型的耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。所有菌株的鉴定和药敏试验是利用BD100全自动细菌鉴定仪完成。对收集的菌株用SDS裂解,蛋白酶K消化,酚-氯仿提取,醋酸钠-乙醇沉淀的方法提取细菌的全基因组DNA。2.常见碳青霉烯酶基因检测利用普通PCR方法对所有菌株进行7种常见碳青霉烯酶基因KPC、NDM、VIM、IMP、SPM、GES、OXA-48,对于鲍曼不动杆菌特别加测OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like四群OXA类的碳青霉烯酶基因。对阳性PCR产物进行测序验证并确定其亚型。对NDM或KPC的阳性菌株进一步扩增16S核糖体基因序列并测序,以保证属种鉴定的准确。3.耐药基因播散方式研究为对NDM和KPC基因进行定位,对NDM或KPC阳性的菌株进行质粒接合转移试验以探讨该耐药基因的播散方式。特别对产KPC的菌株进行MLST分型和基因环境研究,以和国内外已报道情况进行比较。4.常见耐药元件结构研究利用PCR分别扩增Ⅰ类整合子和ISCR1的保守区,阳性菌株进一步扩增二者的可变区,利用限制性内切酶Hinf I和Rsa I酶切可变区,根据酶切图谱进行初步分类,不同的酶切谱型挑选2株进行可变区测序,分析序列的同源性得出耐药基因盒组合。对同时携带整合子和ISCR1的菌株扩增其串联区,以验证是否为复杂性Ⅰ类整合子并通过测序得到复杂性整合子结构。5.NDM和KPC基因双重qPCR法的建立将已知的NDM和KPC基因所有亚型序列分别进行同源性比对,找出保守区进行引物和TaqMan探针的设计。分别构建NDM和KPC基因的质粒标准品,以该标准品对双重qPCR体系进行优化。质粒定量后经过一系列10倍梯度稀释,使其浓度为108copies/μl～101copies/μl,采用优化好的双重体系评价该方法的敏感性和线性关系。同时选取105copies/μ浓度的质粒连续三天重复检测,每次做三个复孔,通过计算各自CT值的变异系数进行重复性和稳定性的评价。利用不含目的基因的标准株(大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923)对该方法进行特异性评价。对经普通PCR和测序验证NDM和KPC基因已知的220株临床分离的肠杆菌科细菌(200株碳青霉烯敏感株和20株非敏感株),利用已建立的双重qPCR方法进行检测,比较与普通PCR检测结果的符合率。研究结果1.碳青霉烯酶基因检测结果16株碳青霉烯耐药肠杆菌科超级细菌中：10株携带NDM-1基因包括4株阴沟肠杆菌、3株肺炎克雷伯菌、1株产酸克雷伯菌、1株产气肠杆菌和1株霍氏肠杆菌(国际首次发现)；1株产气肠杆菌携带IMP-4基因；1株肺炎克雷伯菌同时携带IMP-4基因和KPC-2基因；另外4株菌所有检测的碳青霉烯酶基因均阴性。811株菌共检出6种碳青霉烯酶基因,具体为：鲍曼不动杆菌中碳青霉烯敏感组25株携带OXA-23-like、139株携带OXA-51-like、6株携带OXA-58-like;非敏感组129株携带OXA-23-like、2株携带OXA-24-like、126株携带OXA-51-like、15株携带OXA-58-like;铜绿假单胞菌碳青霉烯敏感组4株携带IMP,非敏感组33株携带IMP、10株携带VIM。其中鲍曼不动杆菌中48株OXA-23-like和OXA-51-like共存；1株OXA-24-like和OXA-51-like共存；14株OXA-58-like和OXA-51-like共存。两属种获得性碳青霉烯酶在敏感组和非敏感组间携带率均有统计学差异,非敏感组均高于敏感组。2.重要基因水平播散方式研究10株NDM阳性的菌株4株成功地将NDM-1耐药基因转移给受体菌,进一步分析质粒发现霍氏肠杆菌携带的复杂性Ⅰ类整合子与NDM-1基因共存于同一个接合性质粒上。肺炎克雷伯菌Car11携带的KPC-2基因位于接合性质粒,但IMP-4并不位于此质粒。对产KPC-2的肺炎克雷伯菌进行MLST分析发现为ST530,这种罕见的ST序列型为国际首次报道。3.Ⅰ类整合子检测结果16株菌中共有10株整合酶扩增阳性,进一步扩增整合子可变区发现10株均阳性。整合子可变区阳性PCR产物测序结果显示这10株菌共携带5种不同类型的基因盒,具体为：肺炎克雷伯菌Car1、产酸克雷伯菌Car4和产气肠杆菌Car12共3株菌携带aar-3+dfrA27基因盒：阴沟肠杆菌Car5-8共4株携带aadB+aadA1基因盒；霍氏肠杆菌Car9携带dfrA16+aadA2基因盒；阴沟肠杆菌Car14携带arr3+aadAl基因盒；肺炎克雷伯菌Car16携带dfrA17+aadA5基因盒。391株鲍曼不动杆菌中230株菌整合子扩增阳性共携带6种不同基因盒排列的Ⅰ类整合子,其中碳青霉烯碳青霉烯非敏感组中135株(78.4%)阳性,敏感组中95(43.4%)株阳性,两组间携带率有统计学差异,非敏感组明显高于敏感组。420株铜绿假单胞菌60株携带共14种不同基因盒排列的Ⅰ类整合子,其中敏感组14株(6.3%),非敏感组46株阳性,两组间携带率无统计学差异。具体为：164株aacA4+catB8+aadA1,48株aacC1+orfP+orfP,12株arr-3+aacA4,1株blaPSE,3株dfrA17+aadA5,2株aacA4。420株铜绿假单胞菌60株携带共14种不同基因盒排列的Ⅰ类整合子。具体为：9株aacA4+aadA2,3株aadAl,aadA2、 cmlA1+aadA2、tetR、oxa-10各1株,aadA4、aacA4各5株,aadB+cmlA6、 aadA7、dfrA17+aadA5各4株,13株aadB+blaPSE-1,2株IMP-9+aadA2,7株aacA4+catB8+aadAl。4.ISCR1检测结果16株肠杆菌科超级细菌ISCR1保守区扩增8株有目的条带扩增,进一步扩增ISCR1可变区发现这8(50%)株菌均阳性,阳性的可变区PCR产物测序结果显示共存在3种不同的可变区类型,具体结果如下：肺炎克雷伯菌Carl、16和产气肠杆菌Car12-13及霍氏肠杆菌Car9共5株ISCR1结构排列为ISCR1+qnrA1+ampR+qacEA1;产酸克雷伯菌Car4ISCR1结构排列为ISCR1+short chain dehydrogenase/reductase+qnrB6+qacE△1;产气肠杆菌Car10和肺炎克雷伯菌Car15共2株ISCR1结构排列为ISCR1+sapA+qnrB2+qacE△1。811株非发酵菌中共185株ISCR1可变区阳性,鲍曼不动杆菌共162株阳性,其中碳青霉烯敏感组72(32.9%)株阳性,非敏感组90(52.3%)株阳性,二组间携带率有统计学差异,非敏感组明显高于敏感组；铜绿假单胞菌共23株阳性,其中碳青霉烯敏感组9(4.1%)株阳性,非敏感组14(7.1%)株阳性,二组间携带率无统计学差异。所有的ISCR1为同一个类型,测序结果显示ISCR1与blaPER-1、GST-like、ABC transporter基因相连。5.复杂性整合子结构肠杆菌科超级细菌中4株Ⅰ类整合子和ISCR1共存的菌株经验证发现两株携带复杂性Ⅰ类整合子,具体为霍氏肠杆菌Car9携带intI1+dfrA16+aadA2+qacdelsul+ISCRl+qnrAl+ampR+qacdelsul;产气肠杆菌Car12携带intI1+aar-3+dfrA27+qacdelsul+ISCRl+qnrA1+ampR+qacdelsul。鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌均存在一种同样排列组合形式的复杂性整合子intI1+aac A4+catB8+aadA1+qacdelsul+ISCR1+blaPER-1+GST-like+ABC transporter+qacdelsul,具体为：鲍曼不动杆菌碳青霉烯敏感组53(24.2%)株阳性,非敏感组73(42.4%)株阳性,两组间携带率有统计学差异,非敏感组高于敏感组,而铜绿假单胞菌碳青霉烯敏感组1(0.5%)株阳性,非敏感组3(1.5%)株阳性,两组间携带率无统计学差异。6.双重qPCR利用质粒标准品优化的双重荧光定量PCR体系来扩增一系列不含NDM和KPC基因的标准株,在NDM和KPC检测通道均未见扩增曲线,证明其特异性好。两种种质粒在108～101copies范围内都有很好的线性关系,最低均能检测到10个拷贝数的质粒。NDM和KPC重组质粒在105拷贝数的批内和批间变异系数均小于5%,说明本研究建立的双重实时荧光定量PCR方法重复性和稳定性好。对220株经普通PCR扩增和测序验证标本采用已建立的双重qPCR体系进行检测,检测结果与普通PCR结果完全符合。结论1.国际首次在霍氏肠杆菌中检出NDM-1基因,并且该基因与基因盒排列为intI1+dfrA16+aadA2+qacdelsul+ISCR1+qnrA1+ampR+qacdelsul的复杂性I类整合子共存于同一接合性质粒上,这种共存模式也为首次报道。国际首次在肺炎克雷伯菌的一种新的序列型ST530中同时检出KPC-2和IMP-4两种碳青霉烯酶。2.我院的肠杆菌科超级细菌主要是NDM-1型,其次是KPC-2型和IMP-4型。非发酵超级细菌中鲍曼不动杆菌主要产OXA类碳青霉烯酶,铜绿假单胞菌主要产IMP和VIM酶,与国内外研究一致。3.肠杆菌科超级细菌和非发酵超级细菌中鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子、ISCR1的阳性率较高,铜绿假单胞菌中二者检出率较低,但含有的基因盒类型多。所有超级细菌中共有两种新型复杂性I类整合子结构检出。4.超级细菌对碳青霉烯耐药的主要原因是产生碳青霉烯酶,尤以KPC型的和NDM型的酶耐药谱更为广泛,水解作用更强,整合子和ISCR等移动耐药元件在耐药基因的水平转移方面有一定的作用,参与介导细菌对多种抗生素耐药,特别是氨基糖苷类、喹诺酮类和β内酰胺类。但总的来说细菌耐药机制是个复杂的过程,通常是多个机制共同作用的结果。5.成功地建立了一种快速、敏感、特异的双重荧光定量PCR方法,能在单一体系同时检测两个重要的碳青霉烯酶基因NMD和KPC。本方法有意识针对NMD和KPC两基因保守区设计引物和探针能同时检测出所有的已知亚型。6.新的耐药基因或耐药形式的出现都是抗生素选择压力的结果，因此合适使用抗生素显得至关重要。另外,目前产碳青霉烯酶菌株的快速出现和播散对全球公共卫生事业造成严重威胁,应及时对常见碳青霉烯酶基因进行检测和监测,防止这种超级细菌蔓延和传播。