氨基酸不仅是蛋白质合成的底物,也是一类外源物信号分子,可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）及下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin,m TOR）信号途径,从而促进蛋白质合成。硒代蛋氨酸（Selenomethionine,Se-Met）是一种蛋白质中含硒的氨基酸,可以作为一种低毒性、低污染、高利用率的饲料添加剂。膜联蛋白Annexin A2是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白(Ca²⁺-dependent phospholipid binding proteins)。实验室前期研究发现,Annexin A2可接受来自氨基酸的信号刺激,并激活下游PI3K-AKT-m TOR信号途径。蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）作为一种广泛分布于人体组织细胞中的激酶,可以激活膜联蛋白Annexin A2磷酸化。尚不清楚Se-Met是否能够调节PKC-Annexin A2信号通路,从而激活PI3K-AKT-m TOR信号途径和促进蛋白质合成。本研究拟揭示Se-Met调节小鼠成肌细胞C2C12蛋白质合成的作用及对以上相关信号通路的调节机理。本研究以体外培养的小鼠成肌细胞C2C12为研究对象。体外培养C2C12细胞,向培养液中分别添加0、25、50、75、100μM的Se-Met,Western blotting检测发现,随着Se-Met浓度的逐渐增加,Cyclin D1蛋白表达水平不断增加,在50μM处理时达到峰值,随后其表达量下降。MTT实验检测490 nm处吸光值发现,在50μM处理时吸光值达到峰值。这些结果表明Se-Met以剂量依赖性形式影响C2C12细胞增殖及细胞周期;Western blotting检测相关蛋白表达变化,发现随着Se-Met浓度的升高,m TOR磷酸化和嘌呤霉素标记的细胞总结构蛋白表达量逐渐增加,在50μM处理时达到峰值,随后蛋白表达含量逐渐降低。这些结果表明,Se-Met能够剂量依赖性的调节C2C12细胞的蛋白质合成。为揭示Se-Met调节C2C12蛋白质合成的信号通路,添加PI3K抑制剂-LY 294002抑制PI3K信号通路。Western blotting检测发现,PI3K抑制消除了Se-Met对m TOR磷酸化和细胞内总结构蛋白水平的刺激作用,表明Se-Met激活m TOR和促进蛋白合成需要PI3K的激活。向培养液中添加Se-Met同时细胞转染Annexin A2 si RNA或过表达Annexin A2、结果发现Annexin A2正向调节Se-Met对PI3K和m TOR磷酸化以及细胞总结构蛋白水平的上调作用。实验室前期质谱结果提示Annexin A2可能结合PKCα。本实验进一步研究了PKCα位于Annexin A2上游并且参与介导Se-Met调节Annexin A2表达和激活的信号通路。Co-IP（Co-Immunoprecipitation）实验证明PKCα结合Annexin A2,添加Se-Met可使二者之间结合作用更加强烈。向培养液中添加Se-Met同时细胞转染PKCαsi RNA,结果发现PKCα敲低显著抑制Se-Met对Annexin A2、PI3K和m TOR的磷酸化作用以及对细胞总结构蛋白水平的上调作用。si RNA转染实验表明PKCα介导Se-Met调节Annexin A2表达和磷酸化激活,提示PKCα可能是Annexin A2的上游激酶。这些数据表明,Se-Met通过PKCα调节Annexin A2磷酸化及其下游途径。综上所述,Se-Met能够剂量依赖性地调节C2C12细胞中Cyclin D1表达、m TOR磷酸化和总结构蛋白合成量。Se-Met通过PKCα-Annexin A2-PI3K信号通路调节以上信号途径,从而影响细胞增殖以及蛋白合成。本研究成果将为Se-Met作为饲料添加剂用于提高畜禽肌肉蛋白质产量提供理论与实验依据。