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一、研究背景糖尿病周围神经病变（Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一,该病是在排除其他原因的情况下,糖尿病患者出现与除脑、脊髓之外的神经组织功能障碍相关的症状与体征。2019年我国成人糖尿病患者已达1.164亿,位居世界首位,其中50%的65岁以上糖尿病患者,会在25年内发展为DPN。DPN以自主神经和运动神经受累为主,多表现为触觉、感觉异常。部分患者可伴有强烈的四肢末端疼痛或麻木感,严重时伴有不同程度的肌力减退、足部溃疡、坏疽、截肢甚至死亡。近年来,尽管糖尿病的早期预防和控制已取得一定成效,但降低的生活质量以及沉重的经济负担,仍然困扰数亿患者。DPN的中医理论发源于《黄帝内经》,在中医古籍中可归属于“消渴”、“痹症”、“麻木”、“不仁”等范畴,现代将其定名为“消渴病痹症”。大量流行病学研究发现,DPN的基本病机为气阴两虚、痰瘀阻络,气虚血瘀是其最多见的中医证型,益气活血法是其主要治法。中药糖痛方在临床应用已20余年,治疗DPN患者上万例,取得了很好的疗效。对糖痛方治疗DPN的疗效特点及分子机制进行研究,将为中医益气活血法防治DPN提供理论和实验依据。细胞自噬是真核生物处理内容性底物,将其运回溶酶体进行降解回收,以维持细胞稳态的一个代谢过程,是细胞的自我防御机制,亦称为“自食”或“自我吞噬”。自噬与高血压、动脉硬化、脂质代谢异常、糖尿病及相关并发症、神经退行性变、肿瘤等许多疾病密切相关。自噬水平的适度升高可减轻诸如缺氧、缺血性损伤等病变所引起的损伤。在正常条件下发生的自噬,通过维持细胞产物的合成与后续循环之间的平衡,在细胞生长、发育、凋亡等阶段起着重要作用。然而,随着自噬水平发生过度升高,机体则常常伴随自噬性细胞死亡。根据自噬运输方式的不同,自噬可分为巨自噬、微自噬、和分子介导的自噬三种类型。细胞自噬围绕许多信号通路发生反应,其中最为瞩目的当属PI3K/Akt/mTOR通路,该通路为细胞自噬和凋亡领域的经典通路。既往研究发现,糖痛方能够调控氧化应激,抑制PARP的活化,抑制NF-κB等炎症因子的表达,从而抑制神经细胞的凋亡。同时还发现,mTORC1的表达在糖痛方不同剂量的干预组中表现出了明显差异。为了进一步探讨益气活血中药糖痛方对细胞自噬的调控作用,本研究基于PI3K/Akt/mTOR信号通路对糖痛方治疗DPN的分子机制进行研究。二、研究目的探讨益气活血中药糖痛方治疗糖尿病周围神经病变的分子机制。三、研究方法采用STZ腹腔注射+下肢缺血再灌注方法,建立糖尿病周围神经病变大鼠模型,记录其血糖水平、体重,检测坐骨神经传导速度及电位波幅,观察其形态学改变。除正常（C）组外,造模成功后的大鼠随机分为模型（M）组、中药低剂量（MT）组、中药高剂量（HT）组,中药连续灌胃8周,将坐骨神经标本进行苏木精-伊红（HE）染色,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、PI3K、Akt、mTOR基因表达水平,蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、PI3K、Akt、mTOR 蛋白表达水平。四、研究结果1.大鼠一般情况DPN造模成功后,与C组相比,M组、MT组、HT组大鼠均逐渐出现毛色发黄、光泽减退,反应迟钝,饮水和排尿量明显增加,瞳孔颜色逐渐变淡,精神不佳,气味重。中药灌胃4周后,C组大鼠毛色皮肤光滑、光泽荣亮,精神状态良好,气味淡,反应灵活;与C组相比,M组大鼠多饮多尿,毛色晦暗无光,并逐渐消瘦,瞳孔呈灰白色,经常蜷卧拱背,反应迟钝;MT、HT组亦出现上述症状,但频率稍低。中药治疗8周后,与C组相比,M组大鼠毛色明显灰黄暗淡,尾尖湿润,皮肤粗糙,多饮多尿,明显萎靡不振,气味重,动作行为迟缓,时有下肢拖行;与M组相比,MT、HT组大鼠多饮多尿,毛色稍有光泽,消瘦减轻,偶尔蜷卧拱背;与MT组相比,HT组大鼠上述症状出现的频率更低。2.大鼠随机血糖及体重情况造模前,各组大鼠血糖水平以及体重均无差异。造模后,与C组相比,M组、MT组、HT组血糖水平均升高（p<0.05）,体重均降低（p<0.05）;中药治疗4周及8周后,与C组相比,M组、MT组、HT组血糖水平下降以及体重增加不明显（p>0.05）。3.大鼠坐骨神经传导速度与电位波幅（1）运动神经传导速度（MNCV）:C组MNCV未见异常;与C组相比,M 组 MNCV 减慢（p<0.05）,与 M 组相比,MT、HT 组 MNCV 提高（p<0.05）;与MT组相比,HT组MNCV提高（p<0.05）。（2）感觉神经传导速度（SNCV）:C组SNCV未见异常;与C组相比,M 组 SNCV 减慢（p<0.05）,与 M 组相比,MT、HT 组 SNCV 提高（p<0.05）;与MT组相比,HT组SNCV提高不明显（p>0.05）。（3）肌肉复合动作电位波幅（CMAP）:C组CMAP未见异常;与C组相比,M组大鼠坐骨神经的CMAP降低（p<0.05）;与M组相比,MT、HT组CMAP 增高（p<0.05）;与 MT 组相比,HT 组 CMAP 增高（p<0.05）。（4）感觉神经动作电位波幅（SNAP）:C组SNAP未见异常;与C组相比,M组大鼠坐骨神经的SNAP降低（p<0.05）;与M组相比,MT、HT组SNAP增高（p<0.05）;与MT组相比,HT组SNAP增高不明显（p>0.05）。4.大鼠坐骨神经HE染色治疗8周后,与C组相比,M组坐骨神经纤维较为松散,排列紊乱,部分纤维肿胀,髓鞘变薄,神经外膜毛细血管扩张充血,炎细胞浸润,部分轴突闭锁;MT组坐骨神经中可见部分正常髓鞘,轴突无明显萎缩,鞘细胞数量增多,髓鞘较薄,有空泡形成;HT组髓神经纤维排列较紧密,鞘细胞数量增加,髓鞘中轴突饱满。5.qRT-PCR（1）LC3Ⅱ:与C组相比,M组LC3Ⅱ基因表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组LC3Ⅱ基因表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组LC3Ⅱ基因表达降低（p<0.05）。（2）Beclin-1:与C组相比,M组Beclin-1基因表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组Beclin-1基因表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组Beclin-1基因表达降低（p<0.05）。（3）p62:与C组相比,M组p62基因表达降低（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组p62基因表达升高（p<0.05）;与MT组相比,HT组p62基因表达升高（p<0.05）。（4）PI3K:与C组相比,M组PI3K基因表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组PI3K基因表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组PI3K基因表达降低（p<0.05）。（5）Akt:与C组相比,M组Akt基因表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组Akt基因表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组Akt基因表达降低（p<0.05）。（6）mTOR:与C组相比,M组mTOR基因表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组mTOR基因表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组mTOR基因表达降低（p<0.05）。6.Western Blot（1）LC3Ⅱ:与C组相比,M组LC3Ⅱ蛋白表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组LC3Ⅱ蛋白表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组LC3Ⅱ蛋白表达降低（p<0.05）。（2）Beclin-1:与C组相比,M组Beclin-1蛋白表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组Beclin-1蛋白表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组Beclin-1蛋白表达降低（p<0.05）。（3）p62:与C组相比,M组p62蛋白表达降低（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组p62蛋白表达升高（p<0.05）;与MT组相比,HT组p62蛋白表达升高（p<0.05）。（4）PI3K:与C组相比,M组PI3K蛋白表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组PI3K蛋白表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组PI3K蛋白表达降低（p<0.05）。（5）Akt:与C组相比,M组Akt蛋白表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组Akt蛋白表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组Akt蛋白表达降低（p<0.05）。（6）mTOR:与C组相比,M组mTOR蛋白表达增高（p<0.05）;与M组相比,MT组、HT组mTOR蛋白表达降低（p<0.05）;与MT组相比,HT组mTOR蛋白表达降低（p<0.05）。五、研究结论益气活血中药糖痛方可以改善DPN大鼠的多饮多尿症状,改善精神状态,提高神经传导速度及波幅,改善神经损伤,增加髓鞘细胞数量,减轻脱髓鞘改变,减轻毛细血管发炎肿胀,改善轴突形态,保护神经纤维结构。其作用机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,从而抑制细胞过度自噬有关。