论文部分内容阅读
第一部分:LHRHa靶向鸦胆子油脂质体的鉴定及其靶向性体外评价目的:鉴定生物素-链酶亲和素桥接法制备LHRHa靶向鸦胆子油脂质体的可行性,并对其靶向性进行体外评价。方法:采用免疫胶体金方法检测靶向鸦胆子油脂质体表面LHRHa靶分子;以香豆素6为荧光探针,制备载香豆素6的LHRHa靶向脂质体(LHRHa-C6-Lipo),设非靶向香豆素6脂质体(C6-Lipo)为阴性对照组,激光共聚焦显微镜观察LHRH受体表达阳性的A2780/DDP细胞及LHRH受体表达阴性的SKOV3细胞对两种脂质体的摄取情况;应用流式细胞仪定量检测A2780/DDP细胞和SKOV3细胞对LHRHa-C6-Lipo、LHRHa-C6-Lipo+游离LHRHa、C6-Lipo相互作用后细胞的荧光强度。结果:制备的LHRHa靶向鸦胆子油脂质体组免疫胶体金染色试验阳性,对照组则为阴性;激光共聚焦显微镜结果显示A2780/DDP细胞对LHRHa-C6-Lipo的摄取明显高于其对C6-Lipo的摄取,但SKOV3细胞对LHRHa-C6-Lipo及C6-Lipo的摄取无明显差异;流式细胞仪检测结果显示A2780/DDP对LHRHa-C6-Lipo的摄取明显高于其对其他两组脂质体的摄取(P<0.05),而SKOV3细胞对三组脂质体的摄取没有明显差异(P>0.05),且同时发现A2780/DDP细胞对LHRHa-C6-Lipo、LHRHa-C6-Lipo+游离LHRHa的摄取明显大于SKOV3细胞(P<0.05),但A2780/DDP细胞和SKOV3细胞对C6-Lipo的摄取没有明显差异(P>0.05)。结论:本实验成功制备了LHRHa靶向鸦胆子油脂质体,该靶向脂质体能与体外培养的A2780/DDP细胞通过受体介导的内吞作用特异性地结合。第二部分:LHRHa靶向鸦胆子油脂质体对人卵巢癌A2780/DDP细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究目的:研究LHRHa靶向鸦胆子油脂质体对人卵巢癌A2780/DDP细胞株增殖抑制、凋亡诱导的作用及其机制。方法:体外培养人卵巢癌细胞株A2780/DDP,制备LHRHa靶向空白脂质体组,采用MTT比色法检测一系列浓度LHRHa靶向空白脂质体对A2780/DDP细胞的毒性作用。根据处理因素不同,将对数期生长A2780/DDP细胞随机分为4组:1.对照组、2.鸦胆子油乳组、3.鸦胆子油脂质体组、4.LHRHa靶向鸦胆子油脂质体组。采用MTT比色法检测各组细胞的增殖抑制率,Hoechst33258染色观察各组细胞核形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,JC-1染色法检测各组细胞线粒体膜电位的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白bax/bcl-2、caspase-3、caspase-8的表达情况。结果:LHRHa靶向空白脂质体浓度从0.5mg/ml增大到8mg/ml,作用时间从24h延长到48h,A2780/DDP细胞的存活率均大于90%;鸦胆子油乳、鸦胆子油脂质体、LHRHa靶向鸦胆子油脂质体均可抑制A2780/DDP细胞增殖,且随着作用时间的延长,抑制作用逐渐增强,其中LHRHa靶向鸦胆子油脂质体组的增殖抑制作用最为显著,24h、48h和72h分别为(37.66±1.73)%、(51.26±3.46)%和(65.45±4.42)%,明显高于同一时间点其他各处理组(P<0.05);Hoechst33258染色显示空白对照组细胞核形态规则,其余三组分别出现不同程度细胞凋亡现象,LHRHa靶向鸦胆子油脂质体组细胞核形态改变程度最严重,流式细胞术检测该组凋亡率为(32.62±0.79)%,明显高于其他各处理组(P<0.05);JC-1染色显示LHRHa靶向鸦胆子油脂质体组A2780/DDP细胞线粒体膜电位下降比例最大,为(38.16±5.08)%,与其他各组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。LHRHa靶向鸦胆子油脂质体能明显增强A2780/DDP细胞bax蛋白、caspase-3蛋白和caspase-8蛋白的表达,降低bcl-2蛋白的表达,与其他各组间相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LHRHa鸦胆子油脂质体能有效抑制卵巢癌A2780/DDP细胞的生长和诱导凋亡,其凋亡机制可能与线粒体途径及死亡受体途径有关。