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目的牙本质敏感(dentin hypersensitivity,DH)是目前临床上最常见的引起患者不适感的病变之一,它是指暴露的牙本质对外界刺激产生短而尖锐的疼痛,并且不能归因于其它特定原因引起的牙体缺损或者病变。关于牙本质的感觉传导机制目前有3种学说:神经末端传导学说(the neural theory)、牙本质细胞传导学说(odontoblastic transduction theory)以及流体动力学说(hydrodynamic theory),近些年在流体动力学说的基础上发展形成了成牙本质细胞流体动力受体学说(odontoblast hydrodynamic receptor theory)。认为外界刺激到达牙本质以后引起牙本质小管内的液体流动不仅能传导到周围的神经末梢,人成牙本质细胞(human odontoblast cells,HODs)位于牙髓最外层,其突起深入牙本质小管内,表达瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)等离子通道蛋白而扮演感觉受体细胞的角色可以直接感知外界伤害性刺激。TRP家族已经被证实参与人感受外界的各种刺激包括机械刺激、化学刺激、温度、酸和渗透压的过程。瞬时受体电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)是目前TRP家族中研究最为广泛的离子通道蛋白之一,又被叫做辣椒素受体,并已经被证实表达于体外培养的HODs-like细胞中,本课题组前期实验也已经证明瞬时受体电位香草酸受体2(transient receptor potential vanilloid-2,TRPV2)以及瞬时受体电位香草酸受体3(transient receptor potential vanilloid-3,TRPV3)在体外培养的HODs-like细胞的表达,TRPV2和TRPV3作为TRPV1的同源异构体,三者具有相似的结构,也具有相似的温度感知区间[TRPV1(>43°C)、TRPV2(>52°C)、TRPV3(33-39°C)],但是三者在HODs-like细胞内亚细胞结构层面上表达分布差异并不清楚。本实验在体外建立HODs-like细胞模型,通过免疫电镜(immunoelectron microscopy,IEM)以及定量IEM分析的方法观察比较研究TRPV1、TRPV2和TRPV3三种温度感觉相关离子通道蛋白在HODs-like细胞层面及其亚细胞水平上的表达和分布差异,为研究TRP通道在牙齿感觉传导作用机制的研究奠定基础。方法选取本课题组前期参照S.Gronthos的方法体外诱导人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells HDPCs)得到的冻存HODs-like细胞,细胞复苏后,选取第三代至第四代且生长状态良好的细胞作为实验对象,首先用免疫荧光(immunofluorescence,IF)以及逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法对体外诱导获得的HODs-like细胞进行鉴定,确定ODs内特征性蛋白质,巢蛋白(nestin)以及牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoproteins,DSPP)的基因以及蛋白质的表达。一部分细胞进行固定,利用IF的方法从细胞层面检测TRPV1,TRPV2和TRPV3三种通道蛋白的表达;选取同一批细胞进行裂解,逆转录RNA获取HODs-like细胞的DNA进行RT-PCR检测;另取同一批细胞固定,制取超薄切片进行IEM研究,在透射电镜放大一万倍下比较观察胶体金颗粒标记TRPV1,TRPV2和TRPV3三种通道蛋白抗原抗体复合物在HODs-like细胞亚细胞结构中的表达,并运用Mayhew提出的基于标记密度(labeling density,LD)与相对标记指数(relative labeling index,RLI)等数据的定量IEM方法,体视学估算以及统计学数据分析这三种离子通道蛋白在HODs-like细胞内细胞器层面上的分布情况。结果(1)IF结果显示HODs-like细胞为核偏位,单侧长突起的细胞,RT-PCR以及IF结果确定HOD-like细胞表达HODs特征性蛋白质,DSPP以及nestin的基因以及蛋白质,验证体外培养的HODs-like细胞具有HODs特性。同时RT-PCR、IF结果从细胞以及基因的层面确定HODs-like细胞内TRPV1,TRPV2和TRPV3三种通道基因以及蛋白的表达。(2)IEM结果证明在HODs-like细胞的亚细胞层面,如细胞质、细胞核、内质网(endoplasmic reticulum,ER)、线粒体、细胞突起和初级纤毛等细胞器内观察到胶体金颗粒标记的TRPV1,TRPV2和TRPV3三种通道蛋白的抗原抗体复合物。(3)定量IEM分析结果显示在亚细胞层面胶体金颗粒标记的TRPV1、TRPV2和TRPV3抗体在初级纤毛、细胞核和细胞质内RLI值均小于1,ER、线粒体和细胞突起内RLI值均大于1,且部分c~2均大于总c~2值的10%,TRPV1、TRPV2和TRPV3通道在HODs-like细胞内线粒体、ER和细胞突起细胞器中优先标记(P<0.001)。结论本实验建立体外培养的HODs-like细胞模型,运用IEM和定量IEM分析方法,证明在HODs-like细胞的亚细胞层面TRPV1、TRPV2和TRPV3三种通道蛋白在细胞核、细胞质、线粒体、ER、细胞突起和初级纤毛等细胞器中表达且表达存在差异,优先标记于内质网、线粒体以及细胞突起内,为TRPV通道在HODs内功能性研究奠定基础。TRPV1,TRPV2和TRPV3三种离子通道蛋白在HODs-like细胞突起上明显优先表达,提示HODs-like细胞突起可能在牙齿感知外界刺激的过程中扮演重要角色。