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黑素皮质素受体-4（Melanocortin-4receptor，MC4R）是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质，跨膜G蛋白耦联受体家族成员之一。猪MC4R基因被认为是影响猪生长肥育的主效基因之一，是参与调控体重、采食和能量平衡的关键信号物质，因此研究MC4R基因的功能及代谢通路具有重要意义。然而在研究真核基因功能的过程中，外源基因的持续表达，会对基因功能的研究有很大的局限性。四环素诱导表达系统的出现克服这个缺点，它已经成为应用最广泛的诱导表达系统，能在时间上调控基因的表达，使基因功能的研究更为细致。本实验采用四环素诱导表达系统（Tet-on），其由转录元件pTet-On载体，反应元件pTRE载体和诱导剂构成。利用分子生物学技术，克隆猪的MC4R基因完整编码区，把猪MC4R基因插入到pTRE载体下游的MCS位点上，从而构建pTRE-MC4R（P1）载体。克隆转录元件pTet-On载体和反应元件pTRE载体的主要片段，将猪的MC4R基因插入到克隆的反应元件的MCS位点上，采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcDNA3.1（+），构建重组质粒pcDNA3.1（+）-rtTA-PTing-MC4R（P2）诱导载体。将重组质粒P1和P2分别转染到猪成纤维细胞中，用诱导剂强力霉素（DOX）在5ug/mL浓度下诱导载体通路的开启，检测该通路中MC4R基因的表达，同时检测诱导前后与MC4R相关基因（MC3R，AGRP，NPY，POMC，Leptin）的表达量变化。为了进一步研究MC4R基因的生物学功能及制备高成活率转基因猪做准备。研究结果如下：1）成功克隆猪的MC4R基因完整编码区序列，大小为999bp2）成功构建了表达猪MC4R基因的两个诱导表达载体P1和P2。3）将载体P1和编码四环素阻遏蛋白的pTet-On载体共转染猪成纤维细胞，加入Dox后，MC4R基因表达量极显著升高（P＜0.01）。4）将融合载体P2转染猪成纤维细胞，加入Dox后，同样，MC4R基因表达量极显著升高（P＜0.01）。5）在重组质粒P2转染猪成纤维细胞中，诱导表达MC4R后，POMC基因表达量显著升高（P＜0.05），而MC3R，AGRP，NPY，POMC，Leptin基因表达水平无显著变化。