【摘 要】
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背景恶性肿瘤是人类健康的重大威胁之一。自19世纪初人们开始用探索用外科手术治疗肿瘤以来,肿瘤的诊疗方法取得了很大的进步。目前以手术治疗、放化疗和靶向治疗为主的肿瘤治疗方法已经在一定程度上改善了肿瘤患者的生存时间和生活质量,但是传统方法对多数恶性肿瘤的治疗效果依然很不理想。以嵌合抗原受体T（Chimeric antigen receptor T（CAR-T））细胞、免疫检查点阻断和肿瘤疫苗为代表的免
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背景恶性肿瘤是人类健康的重大威胁之一。自19世纪初人们开始用探索用外科手术治疗肿瘤以来,肿瘤的诊疗方法取得了很大的进步。目前以手术治疗、放化疗和靶向治疗为主的肿瘤治疗方法已经在一定程度上改善了肿瘤患者的生存时间和生活质量,但是传统方法对多数恶性肿瘤的治疗效果依然很不理想。以嵌合抗原受体T（Chimeric antigen receptor T（CAR-T））细胞、免疫检查点阻断和肿瘤疫苗为代表的免疫治疗已经在血液肿瘤和部分实体瘤中展现出很强肿瘤治疗效果,极大改善了部分患者的生活质量和长期生存状况。其中CAR-T细胞疗法在CD19阳性白血病或淋巴瘤中有效率达到80%以上,但是在实体瘤患者中有效率极低。复杂的免疫抑制性肿瘤微环境是实体瘤区别于血液肿瘤的重要因素之一,也是CAR-T细胞治疗方法在实体瘤中效果不佳的原因之一。研究表明,肿瘤微环境通过多种机制抑制肿瘤组织中T细胞的功能损伤T细胞的生存和增殖能力。而T细胞的代谢对T细胞的增殖分化和功能都有着极其重要的作用,其中脂代谢不仅参与T细胞膜结构的组装还与多种信号传导机制密切相关。前期研究发现肿瘤微环境可以导致T细胞的脂代谢异常。因此本课题在前期发现的基础上探究肿瘤微环境中T细胞脂代谢的分子机制,并靶向异常代谢,改造CAR-T细胞,以增强CAR-T细胞在肿瘤微环境中的功能及增殖能力。方法:1、使用流式细胞术从肿瘤患者外周血和肿瘤组织中分选CD69+CD8+T细胞,进行HPLC-MS检测各种脂质分子的含量2、查询T细胞基因表达数据库中PLPP1,PLPP2,PLPP3基因表达量。3、下载GEO数据库中数据集GSE90728中36例非小细胞肺癌肿瘤浸润CD8+T细胞RNA测序数据,分析PLPP1表达与细胞增殖及T细胞功能相关基因表达的相关性。4、流式检测肺癌患者肿瘤组织中PLPP1高表达和PLPP1低表达的CD8+T细胞功能和增殖能力。5、构建表达PLPP1的MSLN-CAR慢病毒质粒。6、分离培养健康供者外周血CD8+T细胞,经慢病毒感染获得MSLN-CAR-T和MSLN-PLPP1-CAR-T。用流式细胞术检测转染效率,用Western Blot和实时荧光定量PCR检测PLPP1表达7、MSLN-CAR-T/MSLN-PLPP1-CAR-T经CD3/CD28单抗刺激或者与H322细胞系共孵育,检测H322细胞裂解情况,CAR-T细胞活化,功能及细胞增殖情况8、NODSCID小鼠皮下接种H322肿瘤细胞,尾静脉回输MSLN-CAR-T/MSLN-PLPP1-CAR-T测量肿瘤大小,并检测肿瘤组织中CAR-T细胞的功能及增殖能力结果1、HPLC-MS结果显示肿瘤浸润T细胞中磷脂酸（PA）积累,二脂酰甘油（DG）含量降低。2、正常T细胞中PLPP1,PLPP2,PLPP3仅PLPP1有较高表达,GEO数据库中肿瘤浸润CD8+T细胞中PLPP1表达与T细胞功能及细胞增殖相关基因表达正相关。3、肿瘤浸润的CD8+T细胞中PLPP1高表达的细胞亚群功能分子及增殖标记分子表达水平显著高于PLPP1低表达细胞亚群。4、MSLN-CAR-T/MSLN-PLPP1-CAR-T有相似的转染效率,PLPP1在MSLN-PLPP1-CAR-T中表达升高。5、和MSLN-CAR-T相比MSLN-PLPP1-CAR-T功能和增殖能力显著升高。6、MSLN-PLPP1-CAR-T控制肿瘤能力显著增强,肿瘤浸润的CAR-T细胞的功能及增殖能力显著增强。结论实体肿瘤中肿瘤浸润的CD8+T细胞PLPP1表达降低导致细胞磷脂代谢异常,PA异常积累DG含量降低。在肿瘤组织中PLPP1低表达的T细胞功能较差表现出耗竭的表型。PLPP1能增强的CAR-T细胞的功能和增殖能力。在小鼠实体肿瘤模型中,MSLN-PLPP1-CAR-T能更好的控制肿瘤生长。
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