蜡梅Cpcor413pm1基因启动子的克隆及功能初步分析

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蜡梅[Chimonanthus praecox(L.)Link]是我国重要的冬季观赏花卉,在花卉资源相对较少的冬季,蜡梅是重要的鲜切花和盆景材料,具有较高的观赏价值和经济意义。COR基因(Cold-Regulated Gene,COR)为植物所特有的一类低温胁迫响应功能基因,本实验室前期已从蜡梅中克隆到一个与抗寒相关的基因,命名为Cpcor413pm1。本研究克隆了Cpcor413pm1基因上游启动子片段,希望通过对Cpcor413pm1基因启动子的功能分析,探索该基因在蜡梅花抗寒(冻)性形成中的作用机制,主要结果如下:1、Cpcor413pm1基因在蜡梅中的q RT-PCR分析。对蜡梅不同组织、花发育不同时期及不同诱导处理下的Cpcor413pm1基因进行q RT-PCR分析。结果显示,该基因在蜡梅各组织均有表达,在根和花中的表达量相对较高,推测其可能参与根和花的发育调控;在蜡梅花发育各时期,Cpcor413pm1基因均有表达,衰败期的表达量显著高于其他时期,推测该基因或许参与蜡梅花的衰老调控机制;Cpcor413pm1基因在4℃、42℃、脱落酸(ABA)、乙烯(ACC)等不同处理条件下,都能被诱导表达。2、Cpcor413pm1基因启动子克隆。通过染色体步移法获得Cpcor413pm1基因上游1815bp启动子序列,命名为Cpcor413pm1pro。生物信息学分析显示序列中除了启动子基本元件TATA-box、CAAT-box,还有一些非生物胁迫元件如MYB及激素响应元件ABRE、ERE等。3、Cpcor413pm1基因启动子活性验证及稳定表达。根据元件预测结果,对启动子片段进行3段缺失分析(Cpcor413pm1pro-P1/P2/P3),并构建各启动子片断的植物表达载体,然后将各重组载体转化烟草进行瞬时活性验证,将全长片段Cpcor413pm1pro转化拟南芥稳定表达。结果表明各启动子片段均有启动活性,并通过抗性筛选获得转Cpcor413pm1pro拟南芥T2代株系。4、Cpcor413pm1基因启动子组织特异性分析。对转Cpcor413pm1pro拟南芥进行GUS化学染色,结果表明,转基因拟南芥各组织及种子发芽后的各生长时期均能染上色,推测Cpcor413pm1pro无组织特异性,然后对各组织的GUS基因进行q RT-PCR及GUS酶活分析,结果与组织化学染色结果较为一致:在转基因植株各组织均有GUS表达,且GUS活性由高到低依次为根、茎、叶、果、花,说明Cpcor413pm1pro在植物各组织均有活性,是一个组成型启动子。5、Cpcor413pm1基因启动子胁迫响应分析。对转Cpcor413pm1pro拟南芥进行高低温胁迫及ABA和ACC激素诱导后,对转基因拟南芥的GUS基因和GUS酶活进行定量分析,结果表明,在蜡梅Cpcor413pm1pro启动子的驱动下,GUS基因对4℃、42℃、ABA、ACC均有响应。
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