【摘 要】
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气味结合蛋白（Odorant binding proteins,OBPs）是参与昆虫嗅觉识别气味物质的第一步,反向化学生态学是以OBPs为靶标筛选害虫行为活性物质,根据昆虫对特定气味的偏好可设计出对害虫具有引诱作用的引诱剂。斜纹夜蛾是一种杂食性害虫,主要以幼虫为害,因此在斜纹夜蛾的幼虫期进行防治不仅可以减少损失,还能达到更好的防治效果。若是能够明确斜纹夜蛾气味结合蛋白与配体之间的结合机制,将为利用
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气味结合蛋白（Odorant binding proteins,OBPs）是参与昆虫嗅觉识别气味物质的第一步,反向化学生态学是以OBPs为靶标筛选害虫行为活性物质,根据昆虫对特定气味的偏好可设计出对害虫具有引诱作用的引诱剂。斜纹夜蛾是一种杂食性害虫,主要以幼虫为害,因此在斜纹夜蛾的幼虫期进行防治不仅可以减少损失,还能达到更好的防治效果。若是能够明确斜纹夜蛾气味结合蛋白与配体之间的结合机制,将为利用OBPs筛选新型、高效诱剂的研发及基于嗅觉调控的害虫防治策略提供新的靶标。为此,本研究在已发表的斜纹夜蛾成虫与幼虫触角转录组数据的基础上分析筛选并克隆出了2条OBPs基因—SlitOBP11与SlitOBP23。通过RT-qPCR对OBPs基因的表达量进行检测分析;成功表达与纯化了SlitOBP11与SlitOBP23蛋白;使用荧光竞争结合实验测定分析了SlitOBP11和SlitOBP23与植物气味物质及性信息素组分的结合能力,利用行为学实验筛选了能够引起斜纹夜蛾幼虫行为反应的活性物质;通过同源建模和分子对接分析了SlitOBP11与配基的结合位点。主要研究结果如下:1.斜纹夜蛾SlitOBP11与SlitOBP23序列分析与表达谱分析SlitOBP11与SlitOBP23的开放阅读框分别为465bp、438bp,分别编码155个、146个氨基酸。信号肽分析发现SlitOBP11有23个氨基酸残基的信号肽,SlitOBP23有24个氨基酸残基的信号肽。荧光定量结果显示2条OBPs基因在斜纹夜蛾幼虫各个龄期,成虫雌雄的各个组织部位都有表达,表达量也各不相同。从触角的表达量来看,SlitOBP11与SlitOBP23均在幼虫触角中高表达;从部位来看,SlitOBP11在雄虫的头部表达量较高,SlitOBP23在雌虫与雄虫的触角以及足部位的表达较高;从龄期来看,SlitOBP11在1龄期表达量最高,其它龄期的表达量相当,SlitOBP23在3龄期表达量上升,在4、5龄期表达量最高,6龄期表达量开始下降。2.斜纹夜蛾SlitOBP11与SlitOBP23蛋白表达与活性物质筛选利用原核表达系统成功获得SlitOBP11与SlitOBP23可溶性蛋白,竞争结合实验果表明SlitOBP11性信息素有较强的结合能力,其结合常数值分别为Z9,E11-14:Ac Ki=13.88±1.4412μM,Z9,E12-14:Ac Ki=14.40±0.3173μM,Z9-14:Ac Ki=9.97±0.4923μM,E11-14:Ac Ki=13.53±0.4789μM。而SlitOBP23与供试的气味物质结合常数Ki均大于50μM,未检测到有结合能力的物质。为了进一步验证性信息素对斜纹夜蛾幼虫的引诱功能,在其食物中分别加入性信息素Z9,E11-14:Ac、Z9,E12-14:Ac、Z9-14:Ac、E11-14:Ac,发现单独加入四种性信息素的食物对1龄幼虫具有明显的引诱作用。3.斜纹夜蛾SlitOBP11与配体的结合位点分析SlitOBP11具有六个α-螺旋,三个二硫键,属于典型的OBPs结构。分子对接结果显示OBP11的六个α-螺旋形成了开放的疏水性结合腔,存在含有极性原子的配基与结合腔形成氢键作用的可能,在去除信号肽后的第5位谷氨酰胺Gln5,第9位天冬酰胺Asn99,第123位天冬酰胺Asn123可能是形成氢键的潜在位点,特别是位于空腔深处的氨基酸残基Asn99,可能是配体结合中最关键的氨基酸。
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