目的:用构建含沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)血清型D型外膜蛋白2(outer membrane protein 2, Omp2)167～434位氨基酸编码基因(omp2’)的重组表达载体,在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中表达Omp2重组蛋白;免疫BALB/c雌鼠,研制并鉴定其单克隆抗体,为Ct感染诊断试剂盒研制与其致病机制的研究提供实验依据。 方法:将含重组质粒pET28b(+)/omp2’在原核细胞中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot分析和鉴定表达的蛋白;采用强变性尿素溶解包涵体,经过亲和层析法对重组蛋白进行纯化;Bradford法测定纯化的重组蛋白的浓度。采用分步稀释,逐渐降低变性剂的浓度,并在复性缓冲溶液中加入一定量氧化、还原型谷胱苷肽和甘氨酸等,进行复性;用纯化的Omp2重组蛋白(rOmp2’)皮下多点免疫BALB/c雌鼠;无菌操作取其脾细胞,以聚乙二醇作为融合剂,与骨髓瘤细胞融合;有限稀释法进行单克隆化;间接ELISE法筛选阳性克隆;以琼脂糖免疫双扩散法鉴定单抗亚类;间接ELISE法测定腹水效价;细胞涂片染色镜检杂交瘤细胞株染色体数目;流式细胞仪分析杂交瘤细胞DNA含量;Western blot分析其特异性。 结果:SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,基因工程菌表达一相对分子质量(Mr)约为35KDa的目的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经亲和层析后可获得纯度在96%左右的重组蛋白。纯化的rOmp2’免疫BALB/c小鼠,经细胞融