论文部分内容阅读
ARIH2蛋白作为泛素蛋白连接酶E3,在免疫、炎性和发育等过程中发挥关键作用,但具体作用机制尚不明晰。目前,关于鸟类Arih2基因研究未见报道,本研究以鸡为模式动物,克隆不同品系鸡Arih2基因全长编码区序列及其3′-端1169bp非翻译区序列,生物信息学分析ARIH2蛋白序列结构特征及其靶向miRNA,利用定量RT-PCR对Arih2基因及其靶向miRNA的时空表达特性进行鉴定,并对其在炎症与免疫应答中的表达与功能进行初探。主要研究结果如下:首先,分别克隆获得AA~+肉鸡,三黄肉鸡和海兰褐蛋鸡Arih2基因的全长编码区序列均为1473bp,编码490个氨基酸,在三个品系鸡间存在11处SNP位点,且ARIH2蛋白在不同物种间保守性较高。Arih2基因在不同品系鸡的各个组织中均具有转录表达活性。在相同日龄不同品系鸡中,Arih2在血液和脑中具有较高表达活性,并在两品系肉鸡肝脏中均显著高表达(P<0.05);在不同发育阶段海兰褐鸡中,Arih2在心脏和骨骼肌中表达活性逐渐增加,并在10月龄蛋鸡大肠中高表达(P<0.05)。本实验推测Arih2基因可能具有参与肠道黏膜免疫和组织发育等生物学功能。其次,克隆得到三个品系鸡Arih2基因3′-端下游1169nt非翻译区序列,生物信息学预测发现miR-200b-3p可能靶向Arih2的非翻译区序列,进一步克隆获得三个品系鸡pri-miR-200部分序列203bp。组织谱表达分析表明:miR-200b-3p在三品系鸡各组织中均有表达。在14日龄海兰褐鸡的法氏囊中具有显著高表达活性(P<0.05),并且在不同品系鸡和不同发育阶段鸡的上皮组织(例如肾脏、肺脏、皮肤和小肠等)中均具有较高表达活性(P<0.01)。表达活性对比发现Arih2转录活性与miR-200b-3p在多个组织中呈反向差异表达。本实验表明miR-200b-3p可能是积极参与鸡上皮组织发育的重要因子,并且与Arih2基因的转录后调控相关。最后,定量PCR分析Arih2基因和miR-200b-3p在炎症及免疫模型雏鸡多组织中的表达活性变化。在LPS制备的炎症模型雏鸡中,Arih2基因在海兰褐鸡和AA~+鸡的血液(P<0.01)和胸腺(P<0.05)组织中均显著下调表达,而在脾脏(P<0.01)和法氏囊(P<0.05)中显著上调;在新城疫和禽流感疫苗免疫模型海兰褐鸡中,Arih2基因在肝脏和法氏囊(P<0.01)中均显著下调,在血液组织中均显著上调(P<0.01),而在脾脏中两个免疫模型呈现相反变化。miR-200b-3p在炎症模型海兰褐鸡的血液和脾脏中表达显著下调(P<0.05),在肝脏、胸腺、法氏囊、小肠和大肠中表达均显著上调(P<0.05),但在AA~+鸡炎症模型各组织中均显著下调(P<0.05);在新城疫和禽流感免疫模型雏鸡中miR-200b-3p在血液均表达显著下调(P<0.05),而在肝脏、胸腺和法氏囊中均显著上调(P<0.05)。本实验表明miR-200b-3p和Arih2基因均参与雏鸡炎症反应和疫苗免疫应答,表达活性差异可能与其功能特性及鸡的品系特性差异有关。本研究通过对Arih2基因及其相关miRNA的表达与功能特性进行初探,发现Arih2基因和miR-200b-3p是参与机体的发育和免疫调节的重要因子,为深入探索Arih2基因及其相关miRNA的功能与特性奠定基础。