糖胺聚糖是一类广泛存在于动物细胞表面和细胞间基质的线性多糖,是一种复杂的糖类大分子。一般通过共价键连接在核心蛋白上,以蛋白聚糖的形式存在。由于发现糖胺聚糖在黏液分泌过程中具有一定的粘性并具有润滑功能,因此又被称为粘多糖。各种不同组织中所含有的糖胺聚糖各不相同,可以通过结合或者调控等方式在生理及病理过程中与多种蛋白产生相互作用,包括趋化因子、细胞因子、生长因子、成型素、酶和粘附分子等相互作用。另外糖胺聚糖也被认为与许多重要疾病,如炎症、肿瘤等,有密切关系。除了作为生物体内重要的功能物质,糖胺聚糖也是一类重要的生物药物,例如抗凝血药物、抗血栓药物、治疗缓解关节炎的药物等等。肝素作为一种抗凝血药物,被广泛认为是一种具有重要生物功能和独特化学性质的糖胺聚糖多糖。上世纪30年代首次发现肝素可以有效的防止手术后血栓的生成,继而发现可以治疗静脉血栓、肺栓塞、深静脉栓塞等。但是对肝素的使用也引起了一系列不良副反应,如出血并发症或者肝素诱发的血小板减少等等。通过对这些并发症的研究,对凝血机理有了更好的了解,从而引出了对分级肝素——低分子肝素的开发,可以对化学结构和生物特性有更好的了解。低分子肝素的定义为硫酸化的糖胺聚糖盐平均分子量在8000 Da以下,且至少有60%的分子量分布在8000Da以下。低分子肝素是通过控制的化学法或者酶法降解使肝素分子量降低,且抗Xa因子的效价应大于70unit/mg,抗Xa因子活性与抗Ⅱa因子活性的比值应大于等于1.5。目前低分子肝素的生产工艺有以下几类,β-消除降解法、亚硝酸降解法、酶降解法、过氧化物降解法。利用β-消除降解法生产的低分子肝素主要为依诺肝素钠;利用亚硝酸降解法生产的低分子肝素主要品种根据分子量不同分别称为达肝素钠和那屈肝素钙;利用酶降解法生产的低分子肝素主要为汀肝素钠;利用过氧化物降解法生产的低分子肝素有帕肝素钠。对每种低分子肝素各个国家都有明确的要求,包括平均分子量、分子量分布、抗Xa因子与抗Ⅱa因子的效价及其比值、末端结构、硫酸化程度等等。市场份额最高的三种低分子肝素为依诺肝素钠、达肝素钠和那屈肝素钙。在美国的肝素市场超过三亿美元的份额当中,70%来自于依诺肝素钠的销售。除了肝素与低分子肝素,还有一类化学合成的超低分子肝素,主要有磺达肝癸钠和艾卓肝素钠。受疯牛病、肝素污染事件等因素的影响,寻找新的肝素产品生产途径一直是各国科学家努力的方向,使用化学合成法生产肝素产品是首选的代替途径。磺达肝癸钠肝素寡糖药物是基于肝素中与抗凝血酶Ⅲ相互结合的作用位点核心五糖的结构合成的最简洁的肝素产品。磺达肝癸钠与肝素最大的区别即为磺达肝癸钠仅特异性的与抗Xa因子结合,并没有药用肝素的众多重要的药理学特性。另外磺达肝癸钠的半衰期比肝素要更长,但是过量的抗凝血活性不能被鱼精蛋白所中和。糖胺聚糖通过结合或者调控的方式在各项生理功能和疾病的发展过程中发挥着重要的作用。对各种不同来源的糖胺聚糖的研究可以从分子水平上对功能和病理研究给予支持。对健康个体与疾病个体糖胺聚糖含量、种类、组成等方面的差异的研究有助于对生物标志物的探索,进而实现对疾病诊断的辅助作用,同时对于新药开发、药物代谢动力学研究也有极大的帮助。因此对糖胺聚糖的提取、分离及纯化技术的需求也日益强烈。较常见的糖胺聚糖样品来源有各种生物组织、各类细胞以及各种体液。由于不同来源糖胺聚糖的存在形式各有差异,因此针对物理化学性质的差异,对于不同来源糖胺聚糖的提取、分离及纯化技术的开发也有所不同。随着对糖胺聚糖生物功能和生物制药等生物医药方面越来越深入的研究,对糖胺聚糖的分析技术提出了越来越高的要求。对生物样本中糖胺聚糖的研究可以为功能和疾病研究提供分子水平的信息支持,对糖胺聚糖药物结构的表征对药物安全性评估至关重要。如何提高分析的灵敏度和准确度,如何更好更深入的对糖胺聚糖结构进行表征是分析工作者面临的一大挑战。利用高效液相色谱法、毛细管电泳色谱法、凝胶电泳法、核磁共振波谱法以及质谱法可以实现对糖胺聚糖结构的表征。本论文利用亲水相互作用色谱、反相色谱与毛细管电泳色谱等分离技术在线串联各种质谱实现了生物医药相关的糖胺聚糖类药物以及生物样本中提取的糖胺聚糖的定性、定量分析。为糖胺聚糖类药物结构确证提供了简单可靠的分析方法,为生物样品中糖胺聚糖的种类、含量、组成、健康与疾病个体差异等方面的研究提供了有效的技术手段,进而为寻找生物标志物以及新药开发开拓了道路。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种针对依诺肝素钠结构确证的方法我们采用酶法降解与化学法降解相结合的样品处理方法将非还原端、还原端及骨架结构进行区分,并利用亲水相互作用色谱串联多反应监测二级质谱技术对目前已报道的依诺肝素钠所有组成单元结构及部分新发现的结构进行了有效的分离并实现了全面的定性及相对定量分析。共鉴定到并定量了酶解产生的组成单元超过30种,包括天然存在及化学修饰后的各种肝素组成单元,及2个新结构;利用化学氧化及还原鉴定到11种末端结构。本方法经过重复性评价,有较好的稳定性及线性。在依诺肝素钠注射液样品分析中的应用表明本方法在LMWH相似性评价方面有着很高的应用价值。2.建立了一种针对亚硝酸降解制备低分子肝素的结构确证的方法我们使用了一种麦芽糖修饰的亲水相互作用色谱柱对复杂酸性二糖及寡糖的分离进行了优化。使用高分辨串联质谱共清晰的鉴定到亚硝酸降解制备的低分子肝素的36种基本组成单元。同时建立并验证了多反应监测二级质谱定量分析方法对达肝素钠和那屈肝素钙样品进行了对比研究。鉴定并定量的每一部分组成单元都可以揭示这一类低分子肝素不同方面的特性,如具有抗凝血活性的功能区域、来源于原料肝素的结构、降解反应的切割位点以及由于副反应产生的经过修饰的特殊结构等。3.介绍了一种新型串联质谱Interface在低分子肝素药物分析中的应用介绍了一种电动泵毛细管电泳色谱串联质谱方法,适用于分析糖胺聚糖寡糖,并使用了一种新型的interface实现了毛细管电泳色谱与质谱间的完美串联。毛细管电泳色谱分离与电喷雾效果分别使用挥发性的电解质碳酸氢铵与含有甲醇/甲酸的鞘流液进行了优化。实现了对肝素二糖到低分子肝素等各种高硫酸化的肝素寡糖的在线分析,且分析时间均在10分钟左右,为高通量分析提供了可能性。使用该方法,肝素糖链经正向电泳分离后在线串联正离子模式质谱分析,Bottom-up 与 Top-down 两种研究策略均有良好的重现性和较高的灵敏度。4.建立了一种快速分析人尿液中糖胺聚糖成分的方法通过对样品回收率、酶解处理和二糖分析技术等进行优化,建立了一种可以快速对人尿液中含量极低的糖胺聚糖进行定性定量分析的高效液相色谱串联质谱的方法。本方法利用多反应监测技术对经过重组肝素酶和硫酸软骨素酶降解的尿样中的糖胺聚糖进行研究。这一快速灵敏的方法实现了检测尿样中低水平的糖胺聚糖含量和二糖组成,可以检测到比患有如粘多糖病等代谢疾病的患者尿样中含量低10倍到100倍的糖胺聚糖成分。本方法可以检测到正常人尿样中含量极低(ng/mL)的糖胺聚糖,同时还可以检测到炎症、癌症等疾病病人尿样中糖胺聚糖含量和组成细微的差异。5.建立了一套研究新来源糖胺聚糖药物的提取及结构分析的方法建立了一套提取鸡蛋蛋清中硫酸角质素的方法及对所提取到的硫酸角质素进行色谱串联高分辨质谱分析的方法。我们使用商品化的鸡蛋蛋清作为原料,提取硫酸角质素,并利用色谱串联质谱、核磁共振波谱等技术进行结构鉴定,以开拓硫酸角质素的来源。对这种糖胺聚糖的研究对科学研究和药物研发均有重要的意义。另外,本章节中介绍的方法为研究各种组织中糖胺聚糖的结构提供了研究思路。将化学降解、酶解等样品处理方法和色谱、质谱、核磁共振波谱等分析技术相结合,可以对未知结构的、新来源的糖胺聚糖进行全面的结构表征,为功能研究提供有力的结构信息。