漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，其作用底物非常广泛，包括酚类、芳胺类、羧酸类、甾体激素和生物色素等。漆酶不仅在木质素的降解和制浆造纸中有重要的应用前景，而且在废水处理、生物漂白、环境污染物降解、土壤修复、生物监测、食品加工和有机合成等方面也具有潜在的应用价值。　　 目前，自然环境中绝大部分的微生物不易获得分离和培养，这极大限制了人们对微生物资源的有效利用。宏基因组学方法避开了传统的微生物分离培养方法，直接从环境样品中提取总基因组DNA，通过构建和筛选宏基因组文库来获得新的功能基因或生物活性物质。宏基因组文库包括了可培养的和未培养的微生物遗传信息，因此增加了获得新的功能基因和生物活性物质的机会。　　 在论文中，我们从红树林环境样品中提取总基因组，构建了一个的宏基因组文库，并从中筛选获得一个新的漆酶基因。采用大肠杆菌表达系统对该基因进行高效表达，并研究其重组蛋白的酶学性质和在降解环境污染物方面的应用，此外，为了进一步提高该漆酶的酶活性及对环境污染物的降解能力，利用易错PCR技术对该基因进行分子改造。主要研究结果如下：　　 构建了近海红树林环境样品的宏基因组文库，通过功能筛选方法，成功筛选出一个其表达产物具有漆酶活性的新基因，命名为lac591。该基因序列全长1500bp，编码500个氨基酸残基，推测其分子量为57.4 kDa。通过蛋白序列分析发现，漆酶Lac591含有4个作为铜离子结合位点的组氨酸保守区域。同源性比对结果表明，该基因与细菌漆酶有中等程度的同源性，最高的是与嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans C-125)的漆酶为52％。该基因已经提交到GenBank，登录号为GQ468313。　　 将筛选出的漆酶基因lac591连接到pET-32a(+)表达载体上，并转入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中，使用终浓度为1.0 mM IPTG及0.25 mM CuSO4，在30℃诱导8 h，目的蛋白表达量达到最高，为380 mg/L，是已知漆酶基因中的最高表达量。重组漆酶蛋白对多种常见底物的比酶活分别为12.73 U/mg(2，6-DMP)、5.43 U/mg(α-萘酚)、7.35 U/mg(邻苯二酚)、1.02 U/mg(愈创木酚)、0.51U/mg(丁香醛连氮)，以及0.15 U/mg(ABTS)。SDS-PAGE电泳结果表明，纯化后的重组蛋白的分子量约为75 kDa(其中18 kDa为表达载体上的融合蛋白标签分子量)，结合Native-PAGE分析结果，推断该漆酶为单亚基蛋白。酶学性质研究显示，纯化后漆酶对多种研究底物的最适反应pH值分别为8.0(2，6-DMP)，8.2(α-萘酚)，9.0(邻苯二酚)，7.5(愈创木酚)，8.0(丁香醛连氮)以及7.4(ABTS)；在pH7.0～10.0范围内仍能保留大于80％的酶活(以愈创木酚为底物)，表明该酶为碱性漆酶；此外，该酶的最适反应温度为55℃，且在50℃以下温度处理30 min能保留70％以上的酶活性(以愈创木酚为底物)。不同的金属离子对漆酶活性有不同程度的影响，在1 mM低浓度条件下，Ca2+和Fe2+使酶活性分别提高到150％和140％，Mn2+、Mg2+、Co2+、Na+和K+对酶活性影响不明显，Ni+、Zn2+和Al3+则使酶活性降低至77％、55％和68％；而在100 mM高浓度下，Ca2+使酶活性提高2倍，Mg2+、Na+和K+使酶活性分别提高到125％、120％和110％，Mn2+使酶活性降低至70％，Co2+、Zn2+、Fe2+、Ni+和Al3+则使漆酶完全失活。1 mM EDTA能完全抑制重组漆酶Lac591的酶活性；1 mM的尿素和咪唑对酶活性的影响不明显，但100 mM的尿素和咪唑则分别抑制酶活性至20％和46％；1 mM的SDS抑制酶活性至42％，100 mM的SDS则使漆酶完全失活。此外，该酶的动力学参数kcat/Km显示，2，6-DMP为该酶的最适反应底物，其余底物依次为邻苯二酚、α-萘酚、愈创木酚、丁香醛连氮和ABTS。　　 在研究重组漆酶Lac591对环境污染物的降解时发现，在金属离子Ca2+和小分子介体ABTS(或HBT)存在的情况下，重组漆酶Lac591处理染料14 h后，其降解率分别为11％(碱性蓝3)、25％(亚甲基蓝)、57％(溴酚蓝)、60％(结晶紫)、37％(亮蓝R)和10％(酸性紫7)；而对靛红染料，漆酶处理60 min其降解率即可达到100％。此外，在小分子介体ABTS(或HBT)存在的情况下，Lac591处理碱木质素14 h后，其降解率可达11％。结果表明，该漆酶在降解环境污染物中具有一定的应用前景。　　 由于我们所筛选出的漆酶Lac591存在比酶活性较低，因此我们进一步采用定向进化技术对该基因进行分子改造。通过三轮易错PCR方法构建了随机突变文库，以愈创木酚底物酶活力为筛选指标，最终获得酶活性提高的突变酶(Lac3T93)。经氨基酸序列比对，发现突变酶共有4个氨基酸发生了替换，突变点分别是E316V、F62L、V55A和N40S。与野生型漆酶相比较，突变酶的酶活性分别提高了4.1倍(4.10 U/mg，以愈创木酚为底物)，和4.8倍(61.22 U/mg，以2，6-DMP为底物)。突变酶的最适反应温度提高了5℃，达到60℃，其最适反应pH值从7.5提高到8.0(以愈创木酚为底物)，但突变酶的温度和pH稳定性未见明显改善。此外，在相同条件下，突变酶Lac3T93对碱性蓝3、亚甲基蓝、溴酚蓝和结晶紫等染料的降解率分别提高至26％、55％、79％和83％；并且对靛红染料完全降解所需时间由60 min缩短到40 min;突变酶Lac3T93对碱木质素的降解率也由11％提高到15.3％。上述结果表明，在提高漆酶活力和环境污染物降解能力方面，易错PCR的定向进化技术是一种行之有效的方法。　　 通过这些研究的结果表明，利用宏基因组学技术获得的漆酶不仅表达量高、热稳定性较好，以及在碱性环境中具有较高的酶活性，而且对部分染料和碱木质素具有较好的降解效果，为进一步研究近海红树林环境中微生物的其它重要功能基因提供了借鉴作用，具有重要的理论意义和应用前景。