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研究目的乳腺癌是一种起源于上皮细胞的异质性肿瘤,多年来也是世界范围内威胁女性身体健康的头号杀手。粘合连接是上皮细胞的三大主要连接方式（另外两个是紧密连接,桥粒与半桥粒）之一,已经被证实在各种癌症进展中起着至关重要的作用。而对于粘合连接在乳腺癌中的报道还很少。另外一方面,粘合连接相关蛋白1（AJAP1）,又被称作Shrew-1,是最初在上皮细胞中发现的一种新的与粘合连接相关的蛋白。其已被证实在多种肿瘤发展过程中起着重要作用。但是AJAP1在乳腺癌中的作用还未得到充分阐述。本研究旨在分析AJAP1在乳腺癌中的作用以及结合生信结果探索其影响乳腺癌进展的相关机制,并提高对于粘合连接的认识。研究方法1.首先运用数据库分析AJAP1的研究价值,然后运用临床数据分析AJAP1与乳腺癌患者的临床病理参数关系以及对于患者预后的影响;接着选取相关细胞系构建AJAP1过表达和敲除的细胞系,运用MTT、Transwell、划痕、平板克隆、流式细胞学技术来分别检测AJAP1对乳腺癌细胞的迁移、增殖、侵袭能力的影响;2.运用STRING软件分析,找出与AJAP1互作的蛋白β-catenin,然后运用免疫组织化学的方法,根据β-catenin的不同定位并分别分析其与乳腺癌患者的临床病理参数和生存的关系以及与AJAP1表达之间的关系;Co-IP实验、核浆分离实验、泛素化实验、luciferase等实验进一步明确AJAP1与β-catenin的相互调控作用以及对下游通路的影响;在AJAP1 KD组中设计敲除β-catenin的回复实验,体内、体外探讨AJAP1是否是通过β-catenin来发挥其抑制乳腺癌迁移、侵袭、增殖的功能;3.进一步分析并验证AJAP1调控β-catenin轴的上游分子,通过Co-IP实验、免疫荧光、核浆分离实验、luciferase、构建小鼠体内模型等实验明确EGF/EGFR轴对于AJAP1-β-catenin的调控作用;4.另外一方面,在构建AJAP1和Sh AJAP1细胞系过程中,发现细胞形态发生明显变化,接着通过相关实验观察AJAP1对EMT以及TGF-β1诱导的EMT、乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响;5.运用mi Rtarbase和mi RDB数据库网站预测与AJAP1相结合的靶向microRNA,同时通过构建不同区段的突变体,运用luciferase等实验验证AJAP1与其靶向microRNA两者之间的特异性靶向调控关系;并通过MTT等细胞功能学实验确定其靶向microRNA在乳腺癌中的具体作用;随后设计挽救实验验证AJAP1是否能够特异性抑制其靶向mi RNA在乳腺癌中的作用;然后通过Jasper网站预测并用ChIP等实验验证调控AJAP1的EMT相关转录因子(锌指E盒结合蛋白1（Zinc-finger E-box binding protein 1）ZEB1的具体结合位点,从而进一步提示ZEB1-miR-3941-AJAP1在TGF-β1诱导的乳腺癌的迁移侵袭增殖方面的具体调控机制。研究结果1.GOBO、Oncomine和KM-plotter等数据库及283例乳腺癌组织免疫组化结果表明:AJAP1低表达与乳腺癌更高的组织学分级和较多的淋巴结转移个数有关,并且预示着患者的不良预后;细胞功能学实验结果表明AJAP1过表达抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭能力并且流式细胞学周期实验结果证明AJAP1高表达抑制G0/G1期的细胞,提高S期和G2期的细胞比率;2.283例乳腺癌的组织样本的免疫组化结果表明AJAP1的表达水平与β-catenin的不同定位有关,实验结果证实无论内源性还是外源性AJAP1都可以与β-catenin相互结合,形成复合体,而敲除AJAP1过后抑制了β-catenin的泛素化降解,促进了β-catenin在细胞质中积聚进而可以进一步进入到细胞核里,从而激活了β-catenin的转录活性和下游基因的表达;并且回复实验结果证明在Sh AJAP1细胞中敲除β-catenin过后,ShAJAP1促进乳腺癌的增殖、迁移和侵袭的作用被β-catenin明显削弱,说明β-catenin是AJAP1发挥其抑癌作用的中间调控子。3.进一步分析调控AJAP1-β-catenin的上游分子,结果发现EGF能显著降低AJAP1的表达,促进β-catenin的入核活动,Co-IP实验结果证实EGF抑制AJAP1与β-catenin两者复合体的结合效率,luciferase等实验证实EGF抑制β-catenin转录活性,促进β-catenin下游基因C-myc和Cyclin D1的表达,另一方面敲除EGFR过后结果显示明显抑制了AJAP1的表达,并且回复实验结果也证实EGFR/AJAP1 KD组相对于EGFR KD组明显促进β-catenin的启动子活性,而AJAP1也抵消了EGFR在体内促癌作用,以上结果也证明EGF/EGFR信号轴削弱AJAP1的表达进而进一步促进β-catenin的核定位。4.构建AJAP1敲除和过表达细胞系,通过RT-q PCR、Western blot和免疫荧光实验结果发现敲除AJAP1过后显著促进乳腺癌细胞发生EMT,使得上皮标记物E-cadherin表达减少,而间质标记物N-cadherin和Vimentin表达增加,过表达AJAP1过后则取得相反结果;除此之外,通过向细胞中添加TGF-β1观察发现AJAP1能够抑制TGF-β1引起的乳腺癌细胞的增殖、侵袭和EMT。5.为了探究可能调控AJAP1的靶向miRNA,本研究通过数据库及构建相关突变体和luciferase等实验发现miR-3941靶向调控AJAP1的表达,并且KMplotter数据库和相关实验等结果证实miR-3941在乳腺癌组织中含量高,并且其高表达提示患者的较差的预后,此外miR-3941高表达能显著增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力,随后Chip等实验结果证实ZEB1能够结合在AJAP1启动子上的第一个和第三个E-box区域,转录抑制AJAP1的表达同时ZEB1的表达却能被mi R-3941激活。结论在乳腺癌细胞中,目前发现并证实了AJAP1可以通过以下两种路径调控乳腺癌的进展:首先EGF/EGFR负反馈于AJAP1对β-catenin的调控,促进β-catenin入核和其下游基因的表达来调控乳腺癌的进展;另一方面,ZEB1可以结合在AJAP1启动子区域的第一个和第三个E-box区域转录抑制AJAP1的表达,而此过程促进了miR-3941的表达,进一步激活乳腺癌细胞发生EMT和促进TGF-β1诱导的乳腺癌细胞的一系列恶性行为的发生。