桂花花瓣衰老过程中蛋白酶活性变化及其特性研究

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桂花(Dsmanthus fragrans)是我国十大名花之一,素以花香著称。但是由于桂花花期短,凋谢快,因而对观赏和经济价值有一定影响。本研究以柳叶金桂(Dsmanthusfragrans’Liuye Jingui’)为供试材料,从花瓣蛋白酶活性入手,研究了桂花花瓣衰老期间蛋白酶活性和种类的变化规律,建立了桂花花瓣蛋白酶活性底物胶电泳检测体系。探讨了蛋白酶抑制剂、蛋白酶促进剂、6-BA、ABA对桂花衰老进程及可溶性蛋白质、游离氨基酸,蛋白酶活性和种类等生理生化指标变化的影响。从酶水平上探讨桂花衰老的机理,为延缓桂花花瓣衰老提供理论基础。主要研究结果如下:(1)桂花花瓣蛋白酶活性的最适温度为37℃,最适pH为8。在花瓣中可以检测到3种蛋白酶,即丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。其中丝氨酸蛋白酶活性最强,约占总活性的65—75%。(2)在桂花开放至衰老的过程中,蛋白酶活性持续上升,至盛花末期时达到峰值;至萎蔫期时,蛋白酶活性迅速下降。(3)用金属蛋白酶抑制剂EGTA(10mM)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂ZnCl2(1mM)处理桂花花枝,延缓了花瓣衰老,对花瓣蛋白酶活性的增强有一定的抑制作用。蛋白酶激活剂DTT(2mM)、MgSO4(2mM)处理桂花花枝,得到了相反的效果。(4) 6-BA(1mg/L)处理桂花花枝,延缓了花瓣衰老0.4d,对花瓣蛋白酶活性的增强有一定的抑制作用。ABA(5mg/L)处理得到了相反的效果,瓶插寿命缩短了0.4d。(5)建立了花瓣蛋白酶活性的底物胶电泳体系。酶提取液经40℃处理10min,然后在含有0.10%明胶的12%的分离胶上进行电泳,最后24h温育反应后活性带明显显现。(6)底物胶电泳中总共检测到3条蛋白酶带,依其分子量命名为P1(180kD)、P2(94kD)和P3(63kD),其中活性最强的是蛋白酶P3。蛋白酶P2、P3为丝氨酸蛋白酶,蛋白酶P1则同时有半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶活性。蛋白酶P3活性最强,在花瓣衰老的各个阶段都可以检测到,而蛋白酶P1和P2在花瓣萎蔫时几乎完全丧失活性。
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