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背景:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于副粘病毒科,副粘病毒属,是一种有包膜的单股负链RNA病毒,其包膜上镶嵌着两种糖蛋白:血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(fusion protein,F)。F在同源性HN的协助下对膜融合过程和致病作用起到着至关重要的作用。NDV F蛋白由553个氨基酸组成,呈三聚体结构,分为头部、茎部、跨膜区和胞内尾部(cytoplasmic tail,CT)。F蛋白为Ⅰ型糖蛋白,起初为无活性的前体F0,在宿主细胞蛋白酶的作用下被裂解活化为F1和F2两个亚单位,其中F1具有膜融合活性。当前国内外有关NDV F的研究大多集中在胞外区。关于其他副粘病毒的研究显示F的CT对调节病毒的入侵以及F的裂解和融合活性起到了重要作用。NDV F蛋白CT由31个氨基酸构成。经比较发现,不同副粘病毒之间CT的长度以及氨基酸类型有所不同。研究显示,将NDVF胞内尾部整体缺失后严重影响了合胞体的形成。Sergel T等的缺失研究显示,相比胞内尾部前段525-532aa的缺失而言,胞内尾部后段540-546aa的缺失对融合功能的影响更大,但具体发挥作用的氨基酸尚不明了。因此,本研究从胞内尾部后段入手,利用基因定点突变技术对G540、N541、N542、L544、G545、Q546、M547分别突变为丙氨酸(A),从而定位出胞内尾部影响F蛋白功能的关键氨基酸。细胞自噬与病毒之间有着复杂的作用关系,自噬既可以抵抗某些病毒的入侵,也可以为某些病毒复制提供有利条件。研究表明新城疫强毒株Beaudette C株可诱导自噬的产生从而利于其在U251胶质瘤细胞和鸡成纤维细胞(DF-1)中的复制。而对NDV的结构蛋白NP和P蛋白的研究发现其可以通过内质网应激途径诱导自噬,但NDV诱导自噬的分子机制以及包膜糖蛋白HN和/或F对自噬的作用仍需要进一步的研究和探索。目的:1.探讨NDV F胞内尾部对细胞融合过程的影响。2.定位NDV F胞内尾部关键氨基酸。3.研究NDV包膜糖蛋白及F胞内尾部突变体对不同细胞自噬的影响。方法:1.突变体的构建:利用定点突变和同源重组技术从对F功能影响较大的CT后段入手,将 G540、N541、N542、L544、G545、Q546、M547 分别突变为丙氨酸(A),获得7个NDVF CT突变体。2.蛋白的表达:利用重组痘苗病毒的T7瞬时表达系统,将各突变体转染至BHK-21细胞进行蛋白的表达。3.蛋白表达效率的检测:分别用间接免疫荧光法和流式细胞术定性和定量检测各突变体蛋白的表达效率。4.突变体融合活性的检测:采用R18染料转移实验、指示基因法、吉姆萨染色对各突变体蛋白介导细胞融合的三个阶段分别进行定性和定量分析。5.突变体裂解活性的检测:利用Western blot检测突变体功能的改变是否与F蛋白的裂解活化有关。6.自噬标志蛋白的检测:利用Western blot对自噬标志蛋白LC3Ⅱ和p62进行检测,从而判断自噬状态。7.自噬小体的检测:利用免疫荧光法检测不同处理条件下细胞内自噬小体的形成情况,分析NDV包膜糖蛋白及胞内尾部突变体对不同细胞自噬的影响。结果:1.测序结果显示7个NDVF突变体均构建成功,并将其分别命名为:G540A、N541A、N542A、L544A、G545A、Q546A、M547A。2.除M547A的表达水平有所降低之外(为野生型的66.3%),其它各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平均处于野生型F的91.3%～111.4%之间(P>0.05)。3.与野生型F相比,突变体N542A、L544A、M547A的半融合活性均发生了显著变化,分别为野生型的189.8%、58.5%和17.3%,而突变体G540A、N541A、G545A、Q546A的半融合活性处于野生型的80.1%～117.5%之间(P>0.05)。突变体N542A、L544A、M547A的内容物混合能力分别为野生型的248.5%、62.2%和12.6%,其它突变体的内容物混合能力处于野生型F蛋白的95.8%～119.9%之间(P>0.05)。突变体L544A和M547A形成合胞体的大小和数目均有下降,其中M547A几乎丧失了形成合胞体的能力,突变体N542A形成的合胞体的能力则大幅上升。4.各突变体的裂解活性与野生型F相似,N547A表达量有所下降(与上述结果2中一致),但表达的突变蛋白依然可以裂解活化。5.Western blot结果显示三种细胞的各处理组24小时后p62蛋白的水平与空白对照相比差异无统计学意义(P>0.05)。在BHK-21与Vero细胞中单独表达wt HN蛋白未对LC3Ⅱ的含量产生影响,但单独表达wt F/N542A和共表达wt F+wt HN/N542A+wt HN时,LC3IⅡ含量相比空白对照显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05),在DF-1细胞中单独表达N542A和共表达wt F+wt HN/N542A+wt HN时LC3Ⅱ1的含量相比空白对照显著升高(P<0.05)。经雷帕霉素处理和感染NDV BJ株24小时后的细胞中的LC3Ⅱ与空白组相比显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.免疫荧光结果显示,细胞在单独表达wt F/N542A或共表达wt HN+wt F/wt HN+N542A以及感染NDV BJ株24h后时均能在细胞内观察到明显的绿色点状荧光产生。结论:1.NDVF CT对膜融合过程至关重要,该区域氨基酸突变后对F的融合活性有着不同程度的影响。2.N542、L544和M547为NDV F CT的关键氨基酸,对F的融合活性起到了重要作用。3.NDV F在BHK-21和Vero细胞能单独诱导细胞自噬,与HN共同作用时诱导自噬的能力更强。4.F的融合活性越强其诱导细胞自噬的能力也越强。