烟草是我国种植面积最广的经济作物之一,在国民经济与农业生产中具有重要地位。烟叶质量是烟草经济价值的直接体现。其中,烟碱是衡量烟叶化学品质的重要指标,也是影响人们健康的关键因素,适碱少害烟草一直是烟草产业的发展方向。生产上,传统家系选择法和杂交育种法具有育种周期长、工作量大及优良性状遗传不稳定等缺点,在生物技术快速发展的今天,有必要利用分子生物学技术手段,通过筛选烟草烟碱突变体揭示其分子机理,为烟草低碱品种选育与栽培实践提供理论支撑和生产参考。茉莉素信号途径参与烟碱合成代谢和植物抗病调控,茉莉酸可以影响种子萌发和根发育,本研究以此为依据,基于茉莉酸敏感性从烟草激活标签突变体库中筛选烟碱突变体,并对突变体进行生理分析和分子鉴定。主要结果如下:1.茉莉酸辅助筛选烟草烟碱激活标签突变体(1)开发了一种高通量筛选烟草激活标签突变体库的新方法:茉莉酸敏感性辅助筛选烟碱突变体。首先,在茉莉酸选择压力下筛选萌发时间和根长与对照存在差异的突变体;其次,以这些突变体为材料,通过测定打顶前后烟碱含量筛选烟碱突变体;然后,进一步筛选在三代内保持稳定的茉莉酸敏感性和烟碱含量的的突变体。这个突变体筛选方法简单高效、省财省力,同时具有挖掘茉莉酸介导的烟碱合成新基因的潜能。(2)在3000份T1代烟草激活标签突变体库中筛出48个萌发时间和根长具有异常的茉莉酸敏感性的突变体。进一步筛选后一共找到8个烟碱含量异常的突变体,它们在3代内保持稳定的茉莉酸敏感性和烟碱含量。这些突变体可以分为两类,第一类的5个突变体在打顶前后具有相同级别的烟碱含量,分别命名为nit3、nit6、nit7、nit9和nit10。其中nit3和nit6为偏低烟碱突变体,对茉莉酸低敏感;nit7为偏高烟碱突变体,对茉莉酸敏感;nit9和nit10为高烟碱突变体,对茉莉酸高敏感。第二类的3个突变体在打顶前后具有不同级别的烟碱含量,我们将其称为特殊烟碱突变体,分别命名为nit11、nit14、nit17,其中nit11的烟碱含量在打顶前偏低打顶后偏高,对茉莉酸不敏感;nit14的烟碱含量在打顶前偏低打顶后高,对茉莉酸低敏感;nit17的烟碱含量在打顶前高打顶后偏低,对茉莉酸高敏感。2.突变体的生理特性以第一类的5个烟碱突变体和第二类的3个特殊烟碱突变体为材料,测定了茉莉酸甲酯(Me JA)处理及打顶前和处理1天、14天、28天的碳氮代谢酶(INV、GS)活性。同时测定了处理前与Me JA处理及打顶28天的总氮含量、可溶性糖含量,内源激素含量(ABA、IAA、GA、ZR)和光合指标(叶绿素含量、净光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度)。结果如下:(1)第一类5个烟碱突变体的烟碱含量与INV、GS活性负相关,与总氮含量正相关;Me JA处理和打顶能明显降低烟草的GS活性,烟碱含量越高,Me JA处理和打顶对总氮含量的提高越明显;烟碱含量与植物激素ABA正相关,与IAA和GA负相关,Me JA处理和打顶可以明显降低突变体IAA和GA含量;烟碱含量与叶绿素含量、净光合速率、胞间CO2浓度负相关,与气孔导度正相关,烟碱含量越高,Me JA处理和打顶对气孔导度的提高越明显。(2)第二类3个特殊烟碱突变体烟碱含量在打顶前后变化异常,其生理特性与第一类5个烟碱突变体存在差异,nit11烟碱含量在打顶后大幅增加,可能与可溶性糖含量上升、与ABA含量增加以及叶绿素含量和净光合速率下降有关。nit14的烟碱含量在打顶后大幅增加可能与GA含量增加和气孔导度升高有关。nit17的烟碱在打顶后降低可能与总氮含量增加、可溶性糖含量下降、IAA和GA含量下降以及叶绿素含量、净光合速率和气孔导度升高有关。3.突变体分子特性(1)对突变体进行Bar基因检测,结果表明8个突变体均含有p SKI015激活标签;Southern杂交结果表明烟碱突变体nit6、nit9有两个T-DNA插入基因组中,nit3、nit7和nit10各有一个T-DNA插入基因组中;特殊烟碱突变体nit11有两个T-DNA插入基因组中,nit14和nit17各有一个T-DNA插入基因组中。(2)突变体的茉莉酸敏感性和Nt MYC2的表达水平高度一致。(3)第一类5个烟碱突变体中烟碱合成基因的表达水平受JA的影响,且与JA诱导烟碱合成的作用机理相吻合;第二类3个特殊烟碱突变体中烟碱合成基因的表达水平受JA的影响,但每个突变体具有不同的基因表达模式,Me JA处理前,nit11的Nt BBL基因表达量低于对照HD,Me JA处理后,Nt BBL基因表达量明显升高,Nt PMT基因表达量明显低于对照。nit14的Nt ODC基因表达量在Me JA处理前后均低于对照HD;Nt A622基因的表达量在Me JA处理前后均明显高于对照;Nt PMT基因在Me JA处理前表达量高,Me JA处理后表达量明显降低,Nt BBL基因在Me JA处理后不被诱导,Nt NUP1基因在Me JA处理后表达量大幅增加。nit17的大部分烟碱合成基因表达量与对照无显著差异,而烟碱转运基因Nt NUP1的表达量在Me JA处理前后均明显低于对照。4.突变体侧翼序列获得及候选基因预测(1)以第一类5个烟碱突变体和第二类3个特殊烟碱突变体的T4代为材料,用FPNI-PCR、TAIL-PCR、单引物PCR、IPCR和质粒拯救共5种方法扩增突变体侧翼序列,经比较可知,优化后的FPNI-PCR法扩增侧翼序列效果最好,可以作为烟草激活标签T-DNA侧翼序列扩增的首选方法。(2)最终获得10条不同的侧翼序列,与烟草基因组数据库比对后特殊烟碱突变体nit11、nit14和nit17的侧翼序列可以找到同源蛋白,其中nit11找到2个插入位点附近基因,在烟草基因组中的命名分别为Ntab0396680和Ntab0396670。nit14找到2个插入位点附近基因,在烟草基因组中的命名分别为Ntab0583900和Ntab0583910。nit17找到4个插入位点附近基因,在烟草基因组中的命名分别为Ntab0555610、Ntab0555600、Ntab0555620、Ntab0555630。(3)经基因表达量分析后nit11、nit14和nit17各确定了一个候选基因,nit11的候选基因编号为D1-2,对应的烟草基因名称为Ntab0396670;nit14的候选基因编号为D4-1,对应的烟草基因名称为Ntab0583900;nit17的候选基因编号为D7-1,对应的烟草基因名称为Ntab0555610。(4)对3个突变体的候选基因进行茉莉酸应答分析,其中nit17的候选基因Ntab0555610(D7-1)在Me JA处理后少量增加。5.nit17的候选基因分析(1)为了验证nit17的突变表型是由T-DNA插入引起,我们对nit17的10个T2代分离株系进行共分离鉴定,结果表明nit17的突变是由T-DNA插入引起,突变表型在后代发生了分离,在同一株系有突变表型的植株存在杂合基因型,说明该突变是T-DNA单基因控制的显性突变。(2)特殊烟碱突变体nit17的候选基因Ntab0555610与多向耐药性转运蛋白PDR1同源,我们将其命名为NtPDR30。构建带有e GFP的NtPDR30基因过表达转基因株系,在接种烟草白粉病后转基因阳性株和nit17均具有抗病性。(3)对NtPDR30蛋白进行了不同物种间的同源性比较、蛋白质二级结构预测和亚细胞定位,发现NtPDR30蛋白与其它物种PDR蛋白具有较高的同源性,NtPDR30蛋白具有ABC转运蛋白家族特有的NBD-TMD-NBD-TMD结构,并在植物细胞膜上表达。(4)分析了茉莉酸处理前后普通烟草红花大金元(HD)不同组织的NtPDR30基因表达量,发现NtPDR30在烟草根中被茉莉酸诱导。(5)突变体nit17和转基因阳性株T0在打顶和接种EDC后烟碱含量下降。nit17的烟碱合成基因的表达量并未改变,推测nit17烟碱含量下降是烟碱转运能力下降造成,这可能是因为NtPDR30基因过表达后,大大增强了NtPDR30蛋白对其特定转运底物的转运能力,从而降抑制了烟碱合成后的运输。(6)茉莉素调控的烟碱代谢和病害抗性之间存在紧密关联。