研究背景子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)在女性生殖系统肿瘤中占20%-30%,在发达国家的女性恶性肿瘤中位居第四位。在发展中国家,子宫内膜癌的发病率也位居于女性肿瘤的第7位。子宫内膜癌常发于绝经后妇女,但近年临床研究显示,子宫内膜癌有明显的年轻化趋势。虽然早期子宫内膜癌经过规范治疗后,5年的生存率逐年升高,但晚期、低分化子宫内膜癌或者特殊类型的子宫内膜癌预后极差,是导致子宫内膜癌患者死亡的重要因素。因此,子宫内膜癌的发病机理和有效治疗靶点成为改善子宫内膜癌预后的首要课题。目前大多数研究表明子宫内膜癌与长期暴露于无抵抗的雌激素相关,或者与肥胖、高血压、糖尿病相关,但子宫内膜癌发生的机制尚不明确,基因调控异常如基因表达多态性等不足以完全解释子宫内膜癌的发生和发展。近年来的研究表明mircroRNA与子宫内膜癌的发生发展有密切的关系,参与调控子宫内膜癌的进程的分子机制和雌孕激素的表达。miRNA是近些年来研究的热点,是一类广泛存在的非编码单链小分子RNA,是Lee等最早在秀丽线虫中发现的,长度约为19-25个核苷酸。Lee研究团队最早提出了miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。现在人类中miRNA已发现超过1000多个,调控着约30%的人类基因。随后研究在很多恶性肿瘤例如直肠癌、前列腺癌、骨肉瘤中发现miRNA发挥着促癌或抑癌作用。micro RNA通过碱基互补配对的方式与靶基因的3’UTR区域结合,降解靶基因mRNA或阻遏靶基因mRNA的翻译,在转录后水平上负性调控靶基因的表达,从而影响肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移。同样,microRNAs在子宫内膜癌进展的过程中扮演着促癌或抑癌的双重角色,参与到子宫内膜癌发生和进展的各个时期,通过与对应的一个或多个靶基因的3’UTR区域结合,负性调控靶基因的表达。此外miRNA与肿瘤细胞的化疗敏感性密切相关,很在可能成为一个判断子宫内膜癌顺铂治疗预后的标志。miR-135b基因位于第1号染色体长臂第3区2号带的第1号亚带(1q32.1),其存骨肉瘤、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达上升。在非小细胞肺癌中,miR-135b通过激活Hippo信号通路和靶向LZTS1促进肿瘤转移。Arigoni等发现mi R-135b表达上调并通过靶向雌激素受体α、雄激素受体和缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1a)促进乳腺癌和前列腺癌细胞的增殖。miR-135b在人头颈鳞癌细胞中,促进肿瘤细胞的增殖、转移、克隆,以及通过下调FIH的表达、HIF通路的活性,成为致瘤miRNA 。 Valeri等的研究显示,miR-135b的过度表达触发了老鼠和人体APC的缺失,PTEN/PI3K通路的反常,SRC的过度表达及促进肿瘤的转化和进展,]miR-135b的上调在与人类结直肠癌相关的炎症中是普遍事件,并且与肿瘤分期及欠佳的临床结果有密切关系。粪便中的miR-135b,可作为结直肠癌及高级别腺瘤的非侵袭性的生物学标记物。然而miR-135b在子宫内膜癌中的表达、与临床的相关性及其生物学特性,还未有报道。基于miR-135b的研究现状,本课题通过探讨miR-135b在子宫内膜癌组织及4株细胞中表达情况,运用体外细胞实验证明miR-135b的生物学特性,并进一步探讨了miR-135b在子宫内膜癌发生发展中的作用和分子机制,为进一步寻找新的子宫内膜癌发病机制和治疗的靶点奠定了理论基础。方法1 RT-PCR检测miR-135b在子宫内膜癌组织与子宫内膜癌细胞内表达从子宫内膜癌组织和细胞中抽提总RNA,按宝生物公司逆转录及荧光定量PCR试剂盒说明书,经逆转录形成cDNA,根据SYBR Green法进行荧光定量PCR,以2-△△Ct表示基因的相对表达水平。2 RT-PCR检测瞬时转染niRNA135b的转染效率采用阳离子脂质体法,按照LipofectamineTM 3000试剂说明书进行瞬时转染。转染前1天将处于对数生长期的子宫内膜癌细胞株RL-952和Ishikawa消化、离心、计数,约为2×105/孔接种至6孔板中并继续培养,当细胞融合度为30-50%时进行实验。弃上清,加入1.7m1含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基；将购自于RiboBio公司的100nM siRNA加入到无血清培养基中配制混合液①1500,1,吹打混匀；将5μl LipofectamineTM 3000脂质体加入到另一无血清培养基中配制混合液②1500μ1,吹打混匀,室温孵育5min；将混合液②分别加入混合液①中,室温孵育20min,以形成转染复合物,并最终加入到1.7ml含10%胎牛血清的DMEM局糖培养基中,轻摇混匀。其中,mimic NC和inhibitor NC作为内参。48h后抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA, qRT-PCR检测瞬时转染后miR-135b的表达变化。3噻唑蓝(MTT)比色实验检测细胞增殖能力将子宫内膜癌细胞以5×103/孔接种于96孔板中,12h细胞贴壁后转染细胞,分为mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC和空白组,6孔/组,分别于转染后Oh、24h、48h、72h、96h检测一次。检测前每孔中加入5mg/ml的MTT溶液200μl,细胞培养箱中继续培养4h,弃上清,加入DMSO溶液150μl,摇床上室温轻摇10min充分溶解结晶物,以空白孔调零,酶标仪上测定490nm波长处的吸光度值,用来表示细胞增殖能力。各组取6孔平均值,绘制生长曲线。4细胞划痕试验检测细胞迁移能力将子宫内膜癌细胞RL-952接种在六孔板中,瞬时转染48h细胞融合度为90%时,用2000μ1加样枪头,沿直尺垂直培养孔并经过其中点制造“十”字样划痕。弃上清,PBS缓冲液洗2-3次,以去除脱落细胞,更换为无血清培养基继续培养。选取有划痕穿过的视野于0,24h,48h进行拍照,计算并比较各组的迁移率。5 RT-PCR检测FOXO1和HOXA10在子宫内膜癌组织与子宫内膜癌细胞内表达从子宫内膜癌组织和细胞中抽提总RNA,按宝生物公司逆转录及荧光定量PCR试剂盒说明书,经逆转录形成cDNA,根据SYBR Green法进行荧光定量PCR,以2-△△Ct表示基因的相对表达水平。6 RT-PCR检测瞬时转染miRNA135b后FOXO1的mRNA的变化子宫内膜癌细胞株RL-952和Ishikawa转染48h后提取细胞总RNA,按宝生物公司逆转录及荧光定量PCR试剂盒操作,采用△△CT法对荧光定量PCR结果进行定量分析,根据各样本的Ct值,以2-△△Ct表示基因的相对表达水平。7 Western blot检测在FOXO1子宫内膜癌细胞内变化RL-952细胞株转染48h后,提取全蛋白,根据BCA蛋白定量试剂盒进行定量,测定A562。计算各浓度蛋白标准的平均吸光度,绘制标准曲线,计算回归方程。提取的总蛋白,加入2×SDS蛋白上样缓冲液(按1：1比例),100℃煮沸5min.-20℃保存备用。Western blot检测各组FOXO1蛋白的表达。8统计学处理采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。数值大小以均数±标准误来表示。22例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中表达的比较采用两配对样本t检验,其余实验组间比较采用ANOVA单因素方差分析,MTT生长曲线比较采用析因设计的方差分析。所有数据均为3次独立重复实验的结果,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1 RT-PCR检测miR-135b在子宫内膜癌组织内表达应用RT-PCR检测22对配对的子宫内膜癌组织中miR-135b的表达,以1NC为参考值,2-ΔΔCt通过配对样本t检验分析,结果示子宫内膜癌组织中miR-135b的平均表达量为8.3559±10.6692,显著大于子宫内膜癌癌旁组织中niR-135b的平均表达量为4.1930±5.1132,具有统计学意义(t=2.247.P=0.036)。2 RT-PCR检测miR-135b、FOXO1在子宫内膜癌细胞内的表达以JEC细胞为参照(图1),miR-135b在不同细胞中的表达量分别为Ishikawa (111.5150±11.7878)、HEC-1-B (20.8096±5.7010)、RL-952 (1.6737±0.3428)4株细胞之间miR-135b的表达水平有差异,差异有统计学意义(F=129.3,P<0.0001) 。FOXO1在不同细胞中的表达量分别为Ishikawa (0.0640 ± 0.0150), HEC-1-B (0.2994±0.0592)、 RL-952 (0.4548 ± 0.1053)4株细胞之间FOXO1的表达水平有差异,差异有统计学意义(F=85.36,P<0.0001)。3 qRT-PCR检测子宫内膜癌细胞株瞬时转染miRNAs后miR-135b的表达采用脂质体法将miR-135b mimics和inhibitor及其对照imics NC和inhibitorNC转染子宫内膜癌细胞株RL-952和Ishikawa 。转染48h后,提取RNA,逆转录后qRT-PCR检钡miR-135b的表达。结果显示,miR-135b mimics使RL-952、Ishikawa中]miR-135b的表达分别提高了526.39倍(t=-20.189,P=0.002)和32.98倍(t=52.609,P=0.000)；而转染miR-135b inhibitor后,miR-135b的表达分别降低25.28%(t=-23.539,P=0.002)和95%(t=5.966,P=0.027)。4 qRT-PCR检测子宫内膜癌组织和癌旁组织中FOXO1的mRNA的水平应用RT-PCR检测22对配对的子宫内膜癌组织中FOXO1的表达,以1NC为参考值,2-△△Ct通过配对样本t检验分析,结果示子宫内膜癌组织中FOXO1的平均表达量为1.6654±1.6861,显著大于子宫内膜癌癌旁组织中FOXO1的平均表达量为3.2708±3.4159,具有统计学意义(t=-2.559,P=0.018)。5 MTT比色实验我们采用MTT法检测细胞生长曲线,结果显示,转染miR-135b mimic后,RL-952和Ishikawa细胞生长加快(P=0.0000,0.0000)：而转染miR-135b inhibitor后,两种细胞生长速度减慢(P=0.0000,0.0000)。6划痕试验人子宫内膜癌细胞株RL-952转染48h后,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,迁移率=(原始间距一迁移后间距)/原始间距×100。划痕24h后,四个组之间迁移率经统计学分析,具有显著性差异(F=24.67,P=0.0002),划痕48h后,四个组之间迁移率经统计学分析,具有显著性差异(F=36.36,P<0.0001)转染miR-135b mimic后,RL-952在24h和48h的迁移率分别提高了1.54倍(t=-12.01,P=0.0003)和1.54倍(t=7.888,P=0.0014)；而转染miR-135b inhibitor后,RL-952在24h和48h的迁移率分别降低了57.60%(t=4.490,P=0.0109)和44.17%(t=5.123,P=0.0069)。7 qRT-PCR检测子宫内膜癌组织和癌旁组织中FOXO1和HOXA10的mRNA的水平应用RT-PCR检测22对配对的子宫内膜癌组织中FOXO1和HOXA10的表达,以1NC为参考值,2-△△Ct通过配对样本t检验分析,结果示子宫内膜癌组织中FOXO1的平均表达量为1.6654±1.6861,显著大于子宫内膜癌癌旁组织中FOXO1的平均表达量为3.2708±3.4159,具有统计学意义(t=-2.559,P=0.018)。子宫内膜癌组织中HOXA10的平均表达量为1.1473±0.9662,显著大于子宫内膜癌癌旁组织中HOXA10的平均表达量为1.8258±1.0156,具有统计学意义(t=-3.039,P=0.006)。8 qRT-PCR检测瞬时转染miRNA135b后FOXO1的mRNA的水平通过qRT-PCR检钡miR-135b过表达或抑制后的子宫内膜癌细胞株RL-952和Ishikawa中FOXO1 mRNA的表达,我们发现,miR-135b过表达后可显著抑制子宫内膜癌细胞株中FOXO1 mRNA的表达,而抑制miR-135b后FOXO1 mRNA的表达升高。即miR-135b对FOXO1的表达具有负向调控作用。9 Western blot检测在FOXO1子宫内膜癌细胞内变化对RL-952细胞株各组细胞提取全蛋白,具体步骤同前。Western blot检测不同转染细胞后对FOXO1蛋白表达的影响。我们发现,miR-135b过表达后可显著抑制子宫内膜癌细胞株中FOXO1蛋白的表达,而抑制miR-135b后FOXO1蛋白的表达升高,见图6。即miR-135b对FOXO1的表达具有负向调控作用。结论1.miR-135b在子宫内膜癌组织中表达显著高于其对应的癌旁组织。2.miR-135b参与了子宫内膜癌的发病及增殖和迁移作用,其表达失调可影响子宫内膜癌细胞的体外增殖和迁移能力,扮演着癌基因的角色。3. FOXO1在子宫内膜癌组织中较其对应的癌旁组织降低。4. HOXA10在子宫内膜癌组织中较其对应的癌旁组织降低。5.在子宫内膜癌中,FOXO1为miR-135b的靶基因,miR-135b通过靶向FOXO1抑制其转录从而促进子宫内膜癌细胞的发生发展。