灵芝是一种食药用真菌,在几千年前就已被应用于疾病治疗。灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性,因此提高灵芝多糖的生产具有重要的意义。在多糖生物合成途径中,甘露糖磷酸变位酶是参与前体核苷酸糖GDP-甘露糖生物合成的关键酶。并且在某些植物和微生物中,甘露糖磷酸变位酶基因的表达与多糖的生物合成呈正相关。早期研究发现,在灵芝中过量表达多糖生物合成途径中的关键酶基因,能够有效提高灵芝多糖的生物合成。但过量表达甘露糖磷酸变位酶基因对于灵芝多糖生物合成的影响仍不清楚。另一方面,基因调控对于灵芝多糖结构的影响也未知。在本研究中,为了从灵芝中克隆获得甘露糖磷酸变位酶基因,我们运用序列比对分析,同源性分析,测序等方法,从灵芝基因组中成功克隆出了甘露糖磷酸变位酶基因pmm1。pmm1基因序列全长为1154 bp,开放阅读框777 bp,编码259个氨基酸,预测蛋白分子量为65.005 kDa,pmm1编码的蛋白与其他真菌中的甘露糖磷酸变位酶具有90%以上的同源性。为了初步探究过量表达pmm1基因对灵芝胞外多糖生物合成的影响,我们构建了过量表达pmm1基因的工程菌株Oe-pmm1,并对发酵过程中野生型（WT）菌株以及Oe-pmm1菌株的灵芝细胞生长、胞外多糖（EPS）含量以及多糖合成相关基因甘露糖磷酸变位酶2基因（pmm2）以及GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因（gmp）的转录水平进行了检测。发酵培养过程中,WT菌株和Oe-pmm1菌株的EPS含量在第12天达到最大,分别为0.576±0.008 g/L以及1.036±0.036 g/L,Oe-pmm1菌株EPS含量为WT菌株的1.8倍。灵芝多糖生物合成相关基因转录水平分析显示,随着培养天数的增加pmm1基因的表达量呈现上升趋势,在发酵的第9天Oe-pmm1菌株中的pmm1基因表达量是对照WT菌株的40.5±2.38倍。pmm1基因表达量的变化趋势与EPS的积累变化趋势相符。同时过量表达pmm1基因上调了pmm2基因的表达。与WT菌株相比,Oe-pmm1菌株中pmm2基因的转录水平最高上调了2.4±0.04倍。以上结果表明,过量表达pmm1基因增加了灵芝的EPS的生物合成。为了初步探究过量表达pmm1基因对灵芝EPS结构的影响,我们通过FT-IR、HPGPC、HPLC以及甲基化分析的方法对WT菌株的胞外多糖（CW）以及Oe-pmm1菌株的胞外多糖（CP）的结构进行了表征。HPGPC检测结果显示CW具有两个不同的组分,分子量分别为12847.171 kDa以及21.715 kDa;CP为以均一组分,分子量为18.471 kDa。红外检测结果显示两组分具有相似的官能团。单糖组成分析显示,CW和CP都是以葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）以及甘露糖（Man）为主要单糖成分的杂多糖,但CP中的Glc的摩尔比例较CW高13%,而Gal的摩尔比例较CW低11%。甲基化分析显示,CW和CP的糖苷键连接方式相同,为Glcp（1→,→3）Glcp（1→,→6）Glcp（1→,→4）Glcp（1→,→2,3）Glcp（1→,→4,6）Glcp（1→,→6）Galp（1→,→3,4）Manp（1→,→3,6）Manp（1→。但CP中糖苷键→6）Galp（1→的摩尔比例相较于CW低15%,而含有Glc的糖苷键摩尔比例除→2,3）Glcp(1→以外,摩尔比例均升高。此外,我们还检测了CP和CW的DPPH、OH-以及ABTS自由基清除能力。检测结果显示,CP的自由基清除活性显著高于CW。以上结果表明,过量表达pmm1基因影响了灵芝胞外多糖的分子量,组成单糖的摩尔比例以及多糖链中糖苷键的摩尔比例,并且增强了灵芝胞外多糖的抗氧化活性。综上所述,在灵芝中过量表达pmm1基因,增加了灵芝胞外多糖的合成,并且影响了灵芝胞外多糖的结构。本研究为灵芝多糖的高效生产提供了一种新的有效策略,为深入探究pmm1基因对灵芝多糖生物合成的调控机制奠定了基础。